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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-57947
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/5794/


Hrenn, Andrea

Phytochemische Untersuchungen von zwei Heilpflanzen Zentralamerikas sowie pharmakologisch-biologische Untersuchungen von Naturstoffen mit AP-1, MMPs und Humaner Neutrophiler Elastase als molekulare Targets

Phytochemical investigation of two medicinal plants from Central America and pharmacological & biological testing of natural compounds with AP-1, MMPs and Human Neutrophil Elastase as molecular targets

Dokument1.pdf (4.717 KB) (md5sum: 66c8ebe89f6e0083f4c6db4ae7d7e12a)

Kurzfassung in Deutsch

1. Die biologisch kontrollierte Fraktionierung eines Extraktes aus Blättern der traditionell verwendeten Euphorbiaceae Hieronyma alchorneoides Fr. Allemćo, führte zur Isolierung und Strukturaufklärung (mittels NMR- und MS-Untersuchungen) der drei Biflavonoide 7,4‘‘-O-Dimethylamentoflavon (H.1), 7-O-Methyl-amentoflavon (H.2) und Amentoflavon (H.3) sowie von (+)-Catechin (H.4). Die Verbindungen H.1 und H.2 sowie H.4 sind im Rahmen dieser Arbeit erstmals für die Gattung Hieronyma beschrieben worden.
2. Die phytochemische Untersuchung eines Extraktes aus den Blättern von Siparuna thecaphora (Poepp. et Endl.) A. DC. (Siparunaceae), der im MTT-Test eine starke cytotoxische Aktivität aufwies, führte zur Isolierung des Flavonoids 3,7,4‘ Trimethoxykämpferol (S.1) und des Alkaloids Aristolactam AIIIa (S.2). S.1 ist hier für die Art, S.2 für die Gattung erstmals beschrieben. Zur Strukturaufklärung wurden MS- und NMR-Daten eingesetzt.
3. Es konnte gezeigt werden, dass Sesquiterpenlactone aus den Blüten von Arnica montana sowie Arnikazubereitungen die DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors AP 1 in Jurkat-T-Zellen hemmen. Helenalinisobutyrat führte in einer Konzentration von 5 µM zu einer vollständigen Hemmung der IL-1β-induzierten Aktivierung von AP-1. Für den gleichen Effekt wurde von Dihydrohelenalinisovalerianat und Dihydrohelenalinmethacrylat eine Konzentration von ca. 20 µM benötigt. Dies steht im Einklang mit vorhergehenden Analysen mit dem Transkriptionsfaktor NF-κB, die ebenfalls eine stärkere Aktivität von Helenalinderivaten gezeigt haben. In Übereinstimmung damit zeigte eine Tinktur aus mitteleuropäischen (ME), getrockneten Arnikablüten eine deutliche Hemmung der AP-1-DNA-Bindung bei einer Konzentration von 2 µL/mL. Von der Tinktur aus frischen Blüten (ME) und einer Tinktur aus spanischen Arnikablüten waren 5 µL/mL für eine vollständige Hemmung der nach Stimulierung mit IL-1β induzierten Aktivierung von AP-1 erforderlich. Das Gel, das eine Tinktur aus frischen Blüten (ME) enthält, zeigte diesen Effekt bei 10 µL/mL.
4. Weitergehende Untersuchungen zum Wirkmechanismus der AP-1-Hemmung mit Parthenolid und 4β-15-Epoxymiller-9Z-enolid zeigten, dass Sesquiterpenlactone AP 1 direkt angreifen.
5. Die verschiedenen Arnikazubereitungen wurden außerdem auf ihre Hemmaktivität gegenüber der IL 1β-induzierten Expression von MMP1 und MMP13 auf Genebene in Chondrocyten mittels qRT-PCR untersucht. Alle Zubereitungen zeigten eine konzentrationsabhängige, zu der Vergleichssubstanz Helenalinisobutyrat (2 µM) ähnlich starke Verringerung der Genexpression in einem Bereich von 0,2 µL bis 5 µL/mL in bovinen Chondrocyten. Diese starke, konzentrationsabhängige Hemmung konnte exemplarisch auch für Arnikagel in humanen Chondrocyten gezeigt werden.
6. Agrimoniin, Pedunculagin und EGCG konnten als starke direkte Inhibitoren von Humaner Neutrophiler Elastase identifiziert werden. Die IC50 Werte lagen hierbei zwischen 0,9 µM und 25 µM. Sieben weitere phenolische Verbindungen zeigten keine oder nur eine geringe Hemmaktivität. Bei den Untersuchungen, in wieweit die Substanzen die Elastasefreisetzung aus Neutrophilen Granulocyten hemmen können, wurden als aktivste Verbindungen Genistein mit einem IC50-Wert von 0,5 µM sowie Resveratrol mit einem IC50-Wert von 12 µM ermittelt. Alle anderen Substanzen, wie Tyrosol, Hydroxytyrosol, Triacetoxystilben, (+) Epicatechin und (+)-Epicatechin-(4α-8)-(+)-epicatechin, waren schwächer aktiv, die Hemmung lag dort bei einer Konzentration von 50 µM teilweise deutlich unter 50 %.
7. Es wurde ein Elastase-Assay im Arbeitskreis etabliert, um das in Kooperation mit anderen Arbeitskreisen nach Bindungsstudien und chemischer Synthese zur Verfügung stehende Bornyl-3,4,5-trihydroxycinnamat zu testen. Die Aktivität lag mit einem IC50-Wert von 0,54 µM über der der Vergleichssubstanz Bornylcaffeat (IC50-Wert von 1,56 µM).
8. In einem weiteren Kapitel wurde eine Übersicht über die aktuelle Literatur zur Bedeutung von Gerbstoffen bei topischer Anwendung, ihren Einsatzgebieten und möglichen Wirkmechanismen zusammengestellt und diskutiert.


Kurzfassung in Englisch

1. An extract from leafs of the Euphorbiaceae Hieronyma alchorneoides Fr. Allemćo was fractionized under biological control resulting in isolation and structure determination (using NMR and MS methods) of the three biflavonoids 7,4’’-O-dimethylamentoflavone (H.1), 7-O-methylamentoflavone (H.2) and amentoflavone (H.3) as well as (+)-catechin (H.4). Here, compounds H.1, H.2 and H.4 have been identified for the first time in a species of the genus Hieronyma.
2. Phytochemical investigation of an extract from leafs of Siparuna thecaphora (Poepp. et End.) A. DC. (Siparunaceae), which was highly cytotoxic in an MTT-test, led to the isolation of the flavonoid 3,7,4’-trimethoxykaempferol (S.1) and the alkaloid aristolactam AIIIa (S.2). Within the species, S.1, and within the genus, S.2 has not been documented so far. Structure elucidations were done based on MS and NMR data.
3. In Jurkat-T-cells, it was shown that sesquiterpene lactones from Arnica montana flowerheads as well as pharmaceutical preparations of Arnica inhibit binding of the transcription factor AP-1 to DNA. A complete inhibition of the IL-1β-induced AP-1 activation was observed with 5 µM helenalin isobutyrate and 20 µM of dihydrohelenalin isovalerianate or methacrylate. In previous studies using the transcription factor NF-κB as target, helenalin derivatives also showed a higher inhibitory activity. In agreement to this, a more significant inhibition of AP-1-DNA-binding was achieved with a tincture from dried Arnica flowers of Central European origin (CE) at a concentration of 2 µL/mL. A tincture from fresh flowers (CE) and one from Spanish Arnica flowers completely inhibited IL-1β-induced AP-1 activation at 5 µL/mL. The same effect was obtained with 10 µL/mL of a gel, containing a tincture of fresh flowers (CE).
4. Further studies involving parthenolide and 4β-15-expoxymiller-9Z-enolide point to a direct interaction between AP-1 and sesquiterpene lactones responsible for inhibition of the DNA binding.
5. The aforementioned Arnica preparations were tested for their capability to inhibit the IL-1β-induced expression of MMP1 and MMP13 in bovine chondrocytes by means of qRT-PCR. For all preparations, a concentration dependent reduction of gene expression was observed. Depending on the preparation, between 0.2 and 5 µL/mL were needed to equal the effect of helenalin isobutyrate (2 µM) used as reference substance. With the Arnica gel, experiments were repeated in human chondroytes, obtaining the same strong and concentration-dependent inhibition.
6. Agrimoniin, pedunculagin and EGCG were identified as potent direct inhibitors of human neutrophil elastase with IC50-values between 0.9 and 25 µM, whereas only minor or no activity was found for another seven phenolic compounds. The release of elastase from neutrophil granulocytes was most efficiently inhibited by genistein (IC50 = 0.5 µM) and resveratrol (IC50 = 12 µM). All other compounds tested, e.g. tyrosol, hydroxytyrosol, triacetoxystilbene, (+)-epicatechin and (+)-epicatechin-(4α-8)-(+)-epicatechin, were less active, in some cases with an inhibition below 50 % at a concentration of 50 µM.
7. In cooperation with other groups, bornyl (3,4,5-trihydroxy)-cinnamate was tested in molecular modelling and synthesized as a promising optimized elastase inhibitor. The substance was evaluated in a newly established elastase assay and showed an IC50-value of 0.54 µM, thus being more active than the reference substance bornylcaffeate (IC50 = 1.56 µM).
8. As a review, the current literature on tannins for topical therapy, their fields of application and possible modes of action is summarized and discussed.


SWD-Schlagwörter: Naturstoff , Strukturaufklärung , Arnika , Leukozytenelastase
Freie Schlagwörter (deutsch): Gerbstoffe , AP-1 , MMPs , Sesquiterpenlactone
Freie Schlagwörter (englisch): natural compound , structure determination , arnica , neutrophil elastase
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Merfort, Irmgard (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.06.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 02.10.2008
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