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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-59797
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/5979/


Krishnamurthy, Mahalakshmi

Role of a novel SMC-like protein, SbcC2(YhaN) in Bacillus subtilis

Rolle eines neuen SMC-ähnlichen Proteins,SbcC2 (YhaN)in Bacillus subtilis

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Kurzfassung in Deutsch

Genetische Stabilität ist ein sehr wichtiger Faktor für das Überleben in der Natur. Alle Organismen haben mehrere Mechanismen entwickelt, um genetische Stabilität zu erhalten und möglichst exakt auf die nächste Generation zu übertragen. Solche Mechanismen beinhalten fehlerfreie DNA Replikation und DNA Bruch-Reparatur. Die in eukaryontischen Zellen mehrere Meter lange DNA ist prädestiniert durch Strahlung oder Chemikalien angegriffen zu werden. Dies führt zu Millionen von DNA Läsionen pro Tag im Menschen, was zu potentiell schädlichen Mutationen im Genom führt, was die Überlebensfähigkeit der Tochterzellen beeinflusst.
Die zur SMC (structural maintenance of chromosomes) Proteinfamilie gehörigen Polypeptide erfüllen Schlüsselfunktionen in verschiedenen Chromosomendynamiken in fast allen Organismen. SMC Proteine sind zentrale Komponenten con Chromosomen- Kondensations- und Segregationskomplexen, und sind essentiell für die Mitose und die DNA Bruch Reparatur. Sie besitzen eine charakteristische Kopf – coiled coil – Scharnier Struktur, mit Kopfdomänen, die eine ATP Kassetten-Struktur und ATPase Aktivität aufweisen. Die Scharnierdomänen erwirken die Dimerisierung. Anstelle dieser Domäne besitzen Rad50 and SbcC ein CXXC Motif, das eine Zink-Brücke mit einem anderen Monomer ausbilden kann. RecN bildet höhere oligomäre Formen auf noch unbekannte Weise aus.
Bakterielles SMC ist essentiell für die Chromosomensegregation und Kompaktierung, und bildet in der Regel zwei subzelluläre Assemblierungen, je eine in jeder Zellhälfte. Im Gegensatz dazu fungieren Rec50 (in eukaryontischen Zellen), SbcC und RecN in der Reparatur von DNA Schäden und von Doppelstrangbrüchen (DSBs). Nach der Induktion von DSBs initiiert RecN die Bildung von so genannten DNA Reparaturzentren, von denen aus RecA filamentöse Strukturen („threads“ genannt) ausbildet, welche sehr wahrscheinlich „crossovers“ zur Reparatur der DSBs aufbauen.
Ich habe die Funktion von SbcC2 untersucht, dem vierten Mitglied der SMC Proteinfamilie in B. subtilis. Das SbcC2 kodierende Gen ist in den meisten Gram positiven Genomen hoch konserviert, und stellt ein neuartiges SMC Protein dar, welches eine gewisse Ähnlichkeit zu SbcC aufweist, jedoch eine neuartige zentrale Domäne beinhaltet. Durch Transformationsversuche konnte ich zeigen, dass SbcC2 eine wichtige Rolle bei der Transformation in kompetenten Zellen ausübt, welche DNA aus der Umgebung in ihr Chromosom integrieren, wenn genügend Homologie zum Chromosom vorliegt. SncC2 fungiert ebenfalls bei der DNA Reparatur, da sbcC2 Mutanten wesendlich sensitiver gegenüber der Einführung von spezifischen Strangbrüchen im Chromosom als Wildtyp Zellen sind, und ebenfalls sensitiver gegenüber Mitomycin C sind, welches Quervernetzungen in die DNA einführt. Die beiden Phänotypen der sbcC2 Deletion werden deutlich verstärkt durch die zusätzliche Deletion von recN, wodurch die Zellen annähernd so empfindlich werden wie recA Mutanten, denen das zentrale Element der homologen Rekombination fehlt. In der Abwesenheit von SbcC2 und von RecN war die Ausbildung von RecA threads, die auch in kompetenten Zellen während der Rekombination auftreten, stark reduziert, was darauf hindeutet, dass beide Proteine oberhalb von RecA wirken und zwei unterschiedliche Wege für die Presynapse (das Laden von RecA auf einzelsträngige DNA) darstellen. Eine funktionelle SbcC2-YFP Fusion lokalisierte am Zellpol in Kompetenten Zellen, wo die DNA Aufnahme stattfindet, und bildete in 10% von exponentiell wachsenden Zellen diskrete Akkumulationen auf dem Nukleoid. Diese Zahl stieg moderat an nach der Zugabe von DNA schädigenden Agenzien, sowie in Abwesenheit von RecN. DNA-Schadeninduzierte Akkumulationen von SbcC2 entstanden rasch nach der Induktion von Schäden, und kolokalisierten manchmal mit DnaX, einer Komponente der DNA Replikationsmaschinerie. In den meisten Fällen lokalisierten SbcC2-YFP Foci jedoch nicht zusammen mit DnaX.
Diese Daten zeigen, dass die SMC-ähnlichen Proteins in B. subtilis eine Funktion an unterschiedlichen Stellen in der Zelle während der DNA Reparatur ausüben. SbcC agiert ausschließlich an Schäden, die an der DNA Replikationsmaschinerie auftreten, wohingegen RecN und SbcC2 hauptsächlich (allerdings nicht ausschließlich) an der Reparatur von Schäden involviert sind, die an allen anderen Stellen auf dem Chromosom auftreten. Unterstützend für diese Tatsache wurde gefunden, dass RecN-YFP Schadeninduzierte Assemblierung auch in Abwesenheit von aktiver Replikation erfolgt. Die Funktion von SbcC2 wird enorm wichtig beim Fehlen von RecN, was nahe legt, dass es zwei Wege gibt, um DSB Reparaturzentren zu initiieren, einen Hauptweg über RecN, und einen eher konstitutiven Nebenweg über SbcC2. Ich habe ebenfalls die the yhaO (in sbcD2 umbenannt) and yhaM Gene untersucht, die stromaufwärts bzw. abwärts von sbcC2 liegen. Ähnlich wie SbcC2 lokalisierte SbcD2- YFP ebenfalls am Zellpol in kompetenten Zellen. Dies deutet darauf hin dass SbcC2 und SbcD2 miteinander interagieren könnten. YhaM auf der anderen Seite war konstitutiv in der Zelle vorhanden, und kolokalisierte stets mit DnaX. Während der Stationärphase akkumulierte YhaM an den Zellpolen, durch noch unbekannte Faktoren. Einem früheren Artikel zu Folge ist YhaM eine 3'-nach 5' Exoribonuklease, und könnte – basierend auf meinen Daten – an der Reparatur von DNA Schäden beteiligt sein, die an den Replikationsgabeln entstehen.


Kurzfassung in Englisch

Genetic stability is a very important factor for survival in nature. All organisms have developed several mechanisms to maintain genetic stability and faithfully pass it on to the next generation. Such mechanisms include error-free DNA replication and DNA break repair. Several meters long DNA is prone to abuses caused by radiations and action of cell metabolites. This leads to millions of DNA lesions per cell per day, which induce potentially harmful mutations in the cell's genome, affecting the survival of daughter cells.
Proteins belonging to the SMC (structural maintenance of chromosomes) family perform key functions in various chromosome dynamics in almost all organisms. SMC proteins are central components of chromosome condensation and segregation complexes, and are thus essential for either mitosis or for DNA break repair. SMC proteins have a characteristically head/coiled coil/hinge arrangement, with head domains having an ATP cassette fold and ATPase activity. Hinge domains mediate dimerization. Instead of a hinge domain, Rad50 and SbcC contain a CXXC motif that can form a Zn-bridge with another monomer. RecN forms higher multimers in solution, but their architecture is still unclear.
Bacterial SMC is essential for chromosome segregation and compaction and usually forms two subcellular assemblies, one in each cell half. Conversely, SMC 5/6, Rad50, SbcC and RecN are involved in repair of DNA damage and of double strand breaks (DSBs). Upon induction of DSBs, RecN initiates the formation of single defined repair centres (RCs), from which RecA forms filamentous structures (termed threads) that most likely set up crossovers for the repair of DSBs through homologous recombination.
I have analysed the function of SbcC2, a fourth and novel member of the SMC protein family in B. subtilis. The gene encoding for SbcC2 is highly conserved in the genome of most Gram positive bacteria. SbcC2 is most similar to SbcC but lacks the Zn- bridge consensus sequence and instead has a unique central domain. I show that SbcC2 is involved in transformation of competent cells, where a subset of cells take up DNA from the environment and incorporate it into the chromosome, if sufficient homology exists between incoming DNA and a region on the chromosome. I also found that SbcC2 is involved in DSB repair, because sbcC2 mutant cells are more sensitive to the induction of a specific DSB within the chromosome than wild type cells, and are more sensitive to the action of Mitomycin C that induces crosslinks between the DNA strands. The deletion of sbcC2 both phenotypes are strongly acerbated by the additional deletion of recN, rendering cells almost as sensitive to DNA damaging agents as a deletion of recA, encoding for the central protein for homologous recombination. In the absence of both, SbcC2 and RecN, the formation of RecA threads during competence was strongly reduced, suggesting that both proteins act upstream of RecA and provide two distinct avenues for presynapsis (the loading of RecA onto ssDNA at the break site). A functional SbcC2-YFP fusion accumulated at the cell poles in competent cells, and localized as a discrete focus on the nucleoids in 10% of growing cells. This number moderately increased after treatment with DNA damaging agents and in the absence of RecN. Damage-induced foci of SbcC2 arose early after induction of DNA damage and occasionally colocalized with DnaX, a component of the replication machinery, but mostly did not colocalize with DnaX.
My work shows that SMC-like proteins in B. subtilis play roles at different subcellular sites during DNA repair. SbcC operates at breaks occurring at the replication machinery, whereas RecN and SbcC2 function mainly, but not exclusively, at DSBs arising elsewhere on the chromosome. In agreement with this idea, we found that RecN-YFP damage-induced assemblies also arise in the absence of ongoing replication. The function of SbcC2 becomes highly important in the absence of RecN, suggesting that two pathways exist for initiation of DSB repair centres, a major route operated by RecN, and a minor, rather constitutive route involving SbcC2.
I also analysed the yhaO (renamed as sbcD2) and yhaM genes present upstream and downstream of sbcC2, respectively. Similar to SbcC2, SbcD2-YFP also localizes close to the one cell pole during competence. These lines give a strong inclination towards the thought that SbcC2 and SbcD2 interact with each other. However, apart from having various supporting lines for the SbcC2-SbcD2 interaction, I was not able to directly prove this due to technical limitations. YhaM on the other hand, is constitutively present in the cell, often colocalizing with DnaX. Earlier reports suggest that YhaM is a 3'-to-5' exoribonuclease, and based on my results, may be involved in DNA repair occurring at XIII the replication forks. Time-lapse microscopy revealed that certain but not all YhaM foci move in the cell. During stationary phase, YhaM was recruited to the pole by unknown proteins.


SWD-Schlagwörter: Heubacillus , DNS-Reparatur , DNS-Schädigung , DNS , DNS-Doppelstrangbruch , DNS-Klonierung , DNS-Bindungsproteine , Transformation <Genetik> , Homolo
Freie Schlagwörter (englisch): SMC like protein , SbcC2 , YhaN
Institut: Institut für Biologie 2
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Graumann, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.12.2008
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 26.01.2009
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