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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-60095
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6009/


Pohl, Thomas

Lambda-Red vermittelte Mutagenese des nuo-Operons zur Herstellung von Protein-Varianten für die biophysikalische Charakterisierung der Escherichia coli NADH:Ubichinon Oxidoreduktase.

Lambda-red mediated mutagenesis of the nuo-operon for the generation of protein-variants for the biophysical characterization of the Escherichia coli NADH:ubiquinone oxidoreductase.

Dokument1.pdf (7.369 KB) (md5sum: 80a0bfc2694cefe1a37e1da8592b821b)

Kurzfassung in Deutsch

Die energiewandelnde NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, der respiratorische Komplex I, koppelt den Elektronentransfer von NADH auf Ubichinon mit der Translokation von Protonen über die innere mitochondriale Membran der Eukaryonten und die cytoplasmatische Membran der Prokaryonten. Der Komplex I aus Escherichia coli ist aus 13 verschiedenen Untereinheiten namens NuoA-N aufgebaut, deren Gene in dem 15 kbp großen nuo-Operon organisiert sind. Die Größe des Operons erschwert dessen genetische Manipulation, die für die Herstellung von Protein-Varianten zur Charakterisierung des Komplex I erforderlich ist. Ein System zur einfachen und umfassenden Mutagenese des nuo-Operons stand bislang nicht zur Verfügung. Der Komplex weist eine molekulare Masse von 535 kDa auf; seine Assemblierung aus den 13 Nuo-Proteinen ist bislang unverstanden. Durch elektronenmikroskopische Aufnahmen wurde gezeigt, dass der Komplex aus einem in das Cytosol ragenden, peripheren Arm und einem in der Membran eingelagerten Arm besteht. Die hochaufgelöste Struktur des peripheren Armes von Komplex I aus T. thermophilus zeigte die Anordnung der Kofaktoren, einem Flavinmononukleotid und neun Eisen-Schwefel-Zentren, die eine Elektronentransferkette von der NADH- zur Ubichinon-Bindestelle bilden. Das Eisen-Schwefel-Zentrum N7 ist über 20 Å von der Elektronentransportkette entfernt und es war unklar, ob es am Elektronentransfer beteiligt ist. Als Kopplungsmechanismus der Redoxreaktion mit der Protonentranslokation wird sowohl eine direkte, redoxgetriebene, als auch eine indirekte, konformativ getriebene Kopplung, sowie eine Kombination beider Möglichkeiten diskutiert.
Um die Assemblierung des bakteriellen Komplex I zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit 13 Deletionsmutanten, bei denen jeweils eines der Strukturgene des nuo-Operons durch die Insertion einer Resistenzkassette inaktiviert wurde, biochemisch charakterisiert. Es zeigte sich, dass alle Untereinheiten für die Assemblierung eines funktionellen Komplex I benötigt werden. Durch ESR-Spektroskopie, Saccharosegradientenzentrifugation und Western-Blot Analyse wurden Fragmente des Komplex I in der Membran und dem Cytosol der nuo-Deletionsmutanten nachgewiesen, die möglicherweise Intermediate der Komplex I-Assemblierung darstellen.
Mithilfe der Lambda-Red vermittelten Rekombination wurde ein Verfahren zur umfassenden Mutagenese des extrachromosomalen nuo-Operons entwickelt. Die so hergestellten Varianten wurden in einem Stamm, der keine membrangebundenen NADH Dehydrogenasen besaß, überproduziert, womit die direkte enzymkinetische Charakterisierung der Komplex I-Varianten in der Membran ermöglicht wurde. Indem der N-Terminus der Untereinheit NuoF mit einem Histidin-Affinitätspeptid fusioniert wurde, wurde der überproduzierte Komplex I und seine Varianten schnell und effizient mittels Affinitäts-Chromatographie aufgereinigt. Die Präparation war monodispers und zeichnete sich durch eine hohe spezifische Aktivität und einen höheren Lipidgehalt im Vergleich zu der bisherigen Präparation aus. Sie ist damit hervorragend für strukturelle und funktionelle Untersuchungen am Komplex I geeignet.
In dieser Arbeit wurde erstmals das Eisen-Schwefel-Zentrum N7 in Komplex I aus E. coli ESR-spektroskopisch nachgewiesen. Es wurde gezeigt, dass es sich nicht durch NADH reduzieren lässt und daher nicht am physiologischen Elektronentransfer beteiligt ist. Vielmehr wurde durch ortsgerichtete Mutagenese der an der Bindung beteiligten Cysteine nachgewiesen, dass das Zentrum essentiell für die strukturelle Stabilität des Komplex I ist.
Der vorgeschlagene indirekte Kopplungsmechanismus von Elektronentransfer und Protonentranslokation wurde durch den indirekten Nachweis globaler Konformationsänderungen untermauert. Durch ortsgerichtete Spinsonden- und Fluoreszenzmarkierung von Komplex I-Varianten in Kombination mit ESR-Spektroskopie und Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass der Einfluss der NADH-Bindung auf das Ausmaß der Konformationsänderungen geringer und lokaler begrenzt ist, als bisher angenommen wurde.
Mithilfe des hier entwickelten Systems zur Mutagenese des nuo-Operons wurde Komplex I mit Varianten des grün-fluoreszierenden Proteins fusioniert. Dies gestattete erstmals, Komplex I in der cytoplasmatischen Membran fluoreszenzmikroskopisch zu lokalisieren. Seine heterogene Verteilung ist dabei ähnlich zur Verteilung anderer Komplexe der oxidativen Phosphorylierung und dem Diphosphatidylglycerol Cardiolipin. Die Bedeutung dieser Beobachtungen auf zellulärer Ebene für die supermolekulare Organisation der Atmungskettenkomplexe auf molekularer Ebene wird erörtert.


Kurzfassung in Englisch

The energy-transducing NADH:ubiquinone oxidoreductase, the respiratory complex I, couples the electron-transfer from NADH to ubiquinone with the translocation of protons across the inner mitochondrial membrane of eucaryotes or the cytoplasmic membrane of procaryotes. Complex I from Escherichia coli is made of 13 different subunits, named NuoA-N, which are encoded by the 15 kbp large nuo-operon. The size of the operon hampered its genetic manipulation and therefore the generation of protein variants, which are essential for the functional characterization of complex I. A genetic system for the straightforward mutagenesis of the nuo-operon was not available. The protein complex has a molecular mass of 535 kDa and its assembly from the 13 Nuo-proteins is not understood. Electron microscopy has revealed that the complex is made up of a peripheral arm, which protrudes into the cytosol and another arm, which is embedded in the membrane. The high-resolution structure of the peripheral arm of complex I from T. thermophilus revealed the organisation of the redox-active cofactors, namely one flavin mononucleotide and nine iron-sulphur clusters, that constitute an eletron-transfer chain from the NADH to the ubiquinone binding site. It was not known if iron-sulphur cluster N7 is part of this chain, due to its distance 20 Å away from the other cofactors. It was postulated that proton-translocation is indirectly coupled to the redox-reaction mediated by conformational changes.
In this paper 13 different deletion mutants, where the structural genes of the nuo-operon were disrupted by the insertion of antibiotic resistance cassettes, were analyzed by biochemical methods in order to elucidate the assembly of the procaryotic complex I. Its was shown that all subunits are necessary for the production of a functional complex I. Fragments of the complex, which might represent assembly intermediates, were identified by EPR-spectroscopy, sucrose gradient centrifugation and western-blot analyses in the cytosol and cytoplasmic membrane.
By means of lambda-red mediated recombineering, a versatile system for the mutagenesis of the extrachromosomal nuo-operon was established. The enzyme-variants were overproduced in a strain devoid of any membrane-bound NADH dehydrogenases, which allowed the direct screening for functional mutants in the membrane. The N-terminus of subunit NuoF was fused with a histidine affinity peptide, that permitted the fast and efficient isolation of complex I and its variants. The preparation was monodisperse, showed a high specific activity and a higher lipid content compared to standard chromatographic preparations. It is therefore well suited for complex I structural and functional studies.
It was shown by EPR-spectroscopy that iron-sulphur cluster N7 is present in E. coli complex I, but is not reduced with NADH, indicating that this cluster does not participate in the physiological electron transfer. Rather it was demonstrated by site-directed mutagenesis of the binding motif of this cluster, that it is essential for the stability of the complex.
The indirect coupling mechanism between electron transfer and proton translocation was proposed on the basis of experiments which showed that the conformation of complex I changes upon reduction with NADH. Here it was demonstrated by site directed spin and fluorescence labelling in combination with EPR-spectroscopy and fluorescence resonance energy transfer measurements that the extend of the observed conformational changes is much lower than previously assumed.
With the aid of the developed system for the mutagenesis of the nuo-operon, complex I was fused with variants of the green fluorescent protein, which permitted the localization of complex I in the cytoplasmic membrane by fluorescence microscopy. The observed heterogeneous distribution was comparable to the distribution of other complexes of the oxidative phosphorylation and the diphosphatidylglycerol cardiolipin. The significance of this observation on the cellular level in respect to the supermolecular organization of the respiratory complexes on the molecular level is discussed.


SWD-Schlagwörter: NADH-Dehydrogenase <Ubichinon> , Elektronenspinresonanzspektroskopie , Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer , Homologe Rekombination
Freie Schlagwörter (deutsch): Escherichia coli
Freie Schlagwörter (englisch): recombineering
Institut: Institut für Organische Chemie und Biochemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Friedrich, Thorsten (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.10.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 13.11.2008
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