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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-60188
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6018/


Wagner, Judith Nastjenka

The HSP100 protein ClpA: Significance of the N-terminal domain in substrate recognition and binding and characterization of the novel substrate RepE

Das HSP100-Protein ClpA: Bedeutung der N-terminalen Domäne für Substraterkennung und -bindung und Charakterisierung des neuen Substrats RepE

Dokument1.pdf (13.885 KB) (md5sum: 6f74d84ed5c70e268a541396516173be)

Kurzfassung in Englisch

Proteases and molecular chaperones form an intricate triage system, in which substrate specificity is of paramount importance for the correct targeting of a protein into either the degradation or the refolding pathway. The aim of this thesis is to contribute to the understanding of how ClpA, the Hsp100 component of the proteolytic ClpAP machine, recognizes, binds and processes its substrates. The particular focus is on the ClpA N-terminus, a highly mobile domain located at the distal end of the ClpAP complex. Several constructs were designed that either completely lacked the N-terminus or contained point mutations of the well-conserved arginine residues R90 and R131. The effect of these mutations on the degradation of various substrates was tested. The results indicate that the ClpA N-domain assumes a complex role. It is likely to bind to ClpA substrate molecules, but possibly as a secondary binding site after initial contact has been made by another subunit, most likely the D1 domain. The N-terminus may then use its foothold on the substrate to unfold it by exerting a ratchet mechanism.
To expand our knowledge about the mechanism of ClpA-mediated substrate degradation, a novel substrate was sought and found in the plasmid initiator protein RepE. RepE, the product of mini-F plasmid, is a specific ClpAP substrate. However, only the dimeric form of RepE is recognized by ClpA, possibly by trans-recognition, a mode of substrate recognition that depends on the formation of homo- or heterooligomers of the target molecule. RepE is a tightly folded molecule and its degradation is severely inhibited by alterations of the ClpA N-domain. Hence, further evidence for the role of the ClpA N-terminus as an unfoldase could be gathered.

The analyses performed for this work provide new answers concerning the functional characteristics of the ClpA N-terminus and therefore contribute to our understanding of the role that this AAA protein plays within the cellular environment.


Kurzfassung in Deutsch

Für die Funktion eines Proteins ist die korrekte Faltung - oder Tertiärstruktur - von größter Bedeutung. Um diese zu gewährleisten, existiert ein kompliziertes Netzwerk aus Proteasen und molekularen Chaperonen. Um ein missgefaltetes Protein gezielt entweder dem Abbau (Proteasen) oder der Neufaltung (Chaperone) zuzuführen, ist die Substratspezifität von höchster Bedeutung. ClpA ist ein in E. coli vorkommendes Hsp100 Protein. Typischerweise bilden die ClpA Moleküle hexamerische Ringe, welche mit der ClpP-Protease assoziieren und dieser Substrat zuführen können. Das Ziel dieser Arbeit ist es, zum Verständnis beizutragen, wie ClpA Substrat erkennt, bindet und verarbeitet. Im Blickpunkt steht vor allem der ClpA N-Terminus, eine hochgradig mobile Domäne im Bereich des distalen Endes des ClpAP-Komplexes. Dazu wurden mehrere Konstrukte hergestellt, in welchen der N-Terminus entweder deletiert oder durch Punktmutationen im Bereich der hochkonservierten Argininkomponenten R90 und R131 verändert wurde. Der Einfluss dieser Mutationen auf die Degradierung verschiedener Substrate wurde getestet. Die Ergebnisse legen nahe, dass die ClpA N-terminale Domäne Substratmoleküle bindet. Dies erfolgt jedoch vermutlich erst sekundär nachdem eine andere
Untereinheit - am ehesten die benachbarte D1 Domäne - den Initialkontakt hergestellt hat. Der N-Terminus kann das Substrat anschließend mittels eines Hebelmechanismus entfalten. Um unser Wissen bezüglich des durch ClpA vermittelten Mechanismus der Substratdegeneration zu erweitern, wurde ein neues Substrat gesucht und in Form des Plasmid-Initiatorproteins RepE gefunden. RepE - das Produkt des Mini-F Plasmids - ist ein spezifisches ClpAP Substrat. ClpA erkennt nur das RepE-Dimer, nicht jedoch das Monomer. Möglicherweise beruht die Substraterkennung im Fall von RepE auf der sogenannten "Trans-Recognition", einer Form der Substraterkennung, die auf der Bildung von Homo- bzw.
Heterooligomeren des Zielmoleküls beruht. RepE ist ein eng gefaltetes Molekül. Sein Abbau wurde von Alterationen im Bereich des ClpA N-Terminus nachhaltig gestört. Somit ergaben sich weitere Hinweise darauf, dass dem ClpA N-Terminus nicht nur eine wichtige Rolle bei der Bindung, sondern auch bei der Entfaltung von Substratmolekülen zukommt.


SWD-Schlagwörter: Clp <Protease> , Hitzeschock-Proteine , Polypeptidketten bindende Proteine
Freie Schlagwörter (englisch): clpa , hsp100 , chaperone ,
Institut: Inst. für Biochemie und Molekularbiologie
Fakultät: Medizinische Fakultät / Universitätsklinikum
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Bukau, Bernd (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 11.04.2008
Erstellungsjahr: 2007
Publikationsdatum: 13.11.2008
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