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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-63165
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6316/


Lohmüller, Barbara

Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern des Cav1.2 Kalziumkanals

Identification and characterisation of interaction partners of the Cav1.2 Calcium channel

Dokument1.pdf (2.667 KB) (md5sum: 833030453c03b690459be7f84ab97e3f)

Kurzfassung in Deutsch

Im zentralen Nervensystem liegen kalziumaktivierte Kaliumkanäle mit hoher Leitfähigkeit, sogenannte BKCa Kanäle und spannungsaktivierte Kalziumkanäle als makromolekulare Komplexe vor. Diese Komplexe stellen funktionelle Nanodomänen dar, die sicherstellen, dass der Kalziumeinstrom in die Zelle ausreichend hoch ist, um eine Aktivierung der BKCa Kanäle zu gewährleisten. Durch den Kalziumeinstrom werden verschiedene Prozesse aktiviert, unter anderem die Freisetzung von Transmittern an der Synapse, die Kontraktion von Muskeln, die Freisetzung von Hormonen und die Genexpression. Der Kaliumausstrom aus der Zelle wiederum führt zur Repolarisation und setzt eine negative Rückkopplungsschleife in Aktion, die die spannungsaktivierten Kalziumkanäle inaktiviert.
Der L-Typ Cav1.2 Kalziumkanal ist Bestandteil dieser makromolekularen Komplexe. Ob es sich bei der Assoziation zwischen dem BKCa Kanal um eine direkte Interaktion handelt, war bisher noch nicht geklärt. In dieser Arbeit wurde deshalb die Interaktion der beiden Ionenkanäle mit einem auf Hefe basierenden genetischen Screening System, dem Split-Ubiquitin System, mit dem die Interaktion direkt an der zellulären Membran untersucht werden kann, gezeigt. Als Positivkontrolle wurde die Kalziumkanal ß Untereinheit verwendet, die mit der intrazellulären Schleife zwischen Domäne I und II interagiert. Durch die Interaktion der ß Untereinheit mit den entsprechenden Kalziumkanalkonstrukten konnte die korrekte Expression und Faltung der Proteine gezeigt werden. Um die Lokalisation der Interaktion zu identifizieren, wurden mit verschiedenen Konstrukten, die die Domänen des Cav1.2 Kanals enthielten, eine BKCa Kanal Bibliothek gescreent. Dabei wurde ein Fragment des BKCa Kanals isoliert, das mit der ersten Domäne des Cav1.2 Kanals interagiert. Durch verschiedene BKCa Konstrukte konnte die Interaktion im Bereich des BKCa Kanals auf das transmembranäre Segment 6 eingeschränkt werden. Die Aminosäuren im Randbereich des Segments stellten sich als essentiell für die Interaktion heraus. Darüber hinaus wurde durch den Austausch von vier Aminosäuren (Glycin (376) und Leucin (377), Methionin (379) und Phenylalanin (380) gegen Alanin im Zentrum des Segments die Interaktion abgeschwächt. Die Interaktionsstelle im Bereich des Cav1.2 Kanals konnte auf Segment 1 und 3 eingeschränkt werden.
Zusammenfassend wurde im ersten Teil dieser Arbeit zum ersten Mal die direkte Interaktion zwischen der ersten transmemranären Domäne des Cav1.2 Kanals mit dem transmembranären Segment 6 des BKCa Kanals gezeigt.
Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Beteiligung des Cav1.2 Kanals an noch unbekannten Funktionen aufgeklärt werden. Hierfür sollten wiederum mit dem Split-Ubiquitin System in einer Mausgehirn cDNA Bibliothek neue Interaktionspartner des Cav1.2 Kanals identifiziert werden. Hierbei wurde das CART (Cocaine- and amphetamine-regulated transcript) Peptid als Interaktionspartner identifiziert. Das CART Präpropeptid wird nach der Gabe von Kokain in Ratten hochreguliert. Das C-terminale CART Peptid reguliert den Appetit, spielt eine Rolle bei der Stressantwort und inhibiert L-Typ Kalziumkanäle. Bei einer genaueren Eingrenzung des Interaktionsbereichs von CART wurde ein N-termianles CART Peptid inklusive der Signalsequenz identifiziert. Die Signalsequenz dient als Lokalisationssignal des entstehenden Proteins für das Endoplasmatische Retikulum. Dort wird die Signalsequenz vom entstehenden Peptid abgeschnitten. Deshalb liegt das Protein in der Zelle nicht zusammen mit dem Signalpeptid vor und kann in dieser Form in vivo auch nicht an den Cav1.2 Kanal binden. Es wurde jedoch ein Peptid identifiziert, das eine hohe Affinität für den Cav1.2 Kanal hat und auf eine Blockade des L-Typ Kanals getestet werden kann.


Kurzfassung in Englisch

L-type Cav1.2 calcium and BKCa channels are assembled in macromolecular complexes in CNS neurons. Using a yeast based interaction assay we investigated the direct binding of both channels and the location of the interaction site. Here we demonstrate for the first time a direct binding between transmembrane segments of different ion channels. The interaction was found between segment S6 of the BKCa channel and domain I of the Cav1.2 a1 subunit. We narrowed down the interaction site and identified segments IS1 and IS3 of the Cav1.2 channel to be crucial for the binding to the BKCa segment S6.
In the second part of the thesis the interaction with new interaction partners was investigated. The most interesting candidate was CART (Cocaine- and amphetamine-regulated transcript). The interaction takes place between the N-terminal CART peptide including the signal sequence and domain I of the Cav1.2 channel. The signal sequence triggers the new synthesised peptide to the rough Endoplasmatic Retikulum, where the signal sequence is cleaved of. Therefore the N-terminal CART peptide doesn’t exist together with the signal sequence in vivo in the cell. However a peptide with high affinity to the Cav1.2 calcium channel was identified and can be tested for modification of the gating properties.


SWD-Schlagwörter: Calciumkanal
Freie Schlagwörter (deutsch): BK channel, CART
Freie Schlagwörter (englisch): calcium channel
Institut: Inst. für Pharmakologie und Toxikologie
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Klugbauer, Norbert Thomas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 14.02.2009
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 19.02.2009
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