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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-63190
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6319/


Soza-Ried, Cristian A.

Genetic analysis of thymus development in zebrafish (Danio rerio)

Genetische Analyse der Thymusentwicklung im Zebrabärbling (Danio rerio)

Dokument1.pdf (58.956 KB) (md5sum: 81c1a0131139cace567fc361efbcdb5f)

Kurzfassung in Englisch

The zebrafish model has been proposed as a genetic and immunological tool to understand the processes of thymopoiesis and lymphopoiesis. In this work using forward genetic analysis, a collection of three mutants IU191, IP109 and IP045, which exhibited a defect in thymus development were characterized and the mutations were mapped by linkage analysis using SSLP markers for subsequent positional cloning.
The positional cloning revealed that IU191 mutant embryos harbor a mutation (G to A transition) in the splice donor sequence of exon 11 of the gene encoding cleavage stimulation factor subunit-77 kDa (cstf3). The analysis of the mutants revealed that the mutation affects the normal splicing of intron 11, such that exon 11 is followed by the full intron 11 sequence in the mature mRNA. Moreover, by using splice-site morpholino in wild-type embryos, it was possible to reproduce the mutant phenotype and the same splicing defect. The inclusion of the intron 11 generates a premature stop codon, 21 bp into the intron sequence, possibly causing the generation of a truncated CstF protein. These mutant embryos exhibited a defect in the Meckel’s cartilage as determined by Alcian blue staining. However, no subsequent craniofacial defects were observed during further development of these mutants. Furthermore, the pharyngeal arches form normally and foxn1 expression is also normal in the thymic anlage.
Detailed characterization of these mutants by WISH using T-cell markers (rag1, ikaros, ccr9 and tcrβ) showed a severe reduction of thymopoiesis. However, the hematopoietic program was not affected in the mutant, since the expression of gata1 was not affected and l-palstin was affected especially in the thymus. Finally, preliminary results suggest that knock-down of p53 rescues rag1 expression in IU191 embryos.
In the IP109 mutant, a mutation (T to A transversion) in the proto-oncogene cmyb was found. This mutation results in an isoleucine to asparagine substitution in the R3 repeat of the DNA binding domain. These mutants lack thymopoiesis since T-cell markers (rag1, ikaros, ccr9, gata3 and tcrβ) are absent of the thymic anlage. However, the primitive hematopoiesis is not affected, given that these mutants have only a slightly reduction on gata1, cmyb and l-plastin. No tcrβ transcripts could be obtained by RT-PCR from IP109 mutants, indicating that V(D)J recombination is absent in these mutants. Finally, in order to prove that the phenotype was caused by the mutation in cmyb, a rescue by BAC (with the sequence of the wild-type cmyb) injection was attempted. Only 12.5% instead of the expected 25% injected fish did not exhibit rag1 expression in the thymus. Moreover, 9 fish that were homozygous for the mutant allele at flanking markers showed normal rag1 expression in the thymus, suggesting that the BAC injection rescued the wild-type rag1 expression in the thymus.
Finally the mutant IP045 was characterized with T-cell markers (rag1, ikaros, and tcrβ) and the macrophage marker l-plastin. This mutant exhibited a severe reduction in thymopoiesis. So far, the mutation that affect this line was linked to the chromosome 8 and the critical interval (6.26 cM) was defined by flanking markers.


Kurzfassung in Sonst.

Zebrafish ha sido considerado como un modelo genético e inmunológico ideal para la identifiación de genes involucrados tanto en el desarrollo del timo como en la diferenciación de las células linfoides.
En el presente trabajo, se analizó una colección de tres mutantes (IU191, IP109 y IP045), a través de “forward genetics”, los cuales excibían defectos en el desarrollo del timo. La mutación responsable fue identificada usando marcadores moleculares (SSLP), y los mutantes fueron caracterizados mediante diferentes técnias moleculares.
El clonamiento posicional de la mutación responsable del fenotipo IU191, reveló un cambio de base (G to A) en la última base nucleótidica del exón 11 (donor splicing) del gen que codifica para la subunidad 77 kDa del “cleavage stimulation factor” (cstf3) . Esta mutación impide el “splicing” normal de este exón, provocando la inserción de la secuencia intrónica. Esta al ser incluida, provoca la aparición de un “stop codon” después de 21 pares de bases, posiblemente abortando la producción de una proteína normal. Además, a través de la injección de morholinos en embriones control (silvestres), fue posible reproducir el fenotipo mutante.
Estos mutantes también presentan una deformación del cartílago de Meckel. Sin embargo, otras estructuras cranio faciales no presentan ningún defecto en comparación a los individuos controles. Es mas, la formación de los arcos branquiales y la cavidad tímica (formada por células epiteliales del timo) es normal, de acuerdo a la expresión de foxn1.
La caracterización detallada de estos mutantes mediante hibridación “in situ”, usando sondas específicas para linfocitos T (rag1, ikaros, ccr9 and tcrβ) demostraron que en ellos existe una severa reducción en la timopoiesis. No obstante, el análisis del programa hematopoietico, de acuerdo a la expresión de gata1, demostró que al menos durante la primera fase hematopoiética estos mutantes no presentan ninguna anomalía. De hecho, la expresión de l-plastin en estos mutantes se ve muy afectada en el timo pero no en otras regiones de estos embriones. Finalmente, resultados preliminares sugieren que al abolir la función de p53 es posible recobrar la expresión de rag1 en los mutantes IU191.
El analysis de los embriones mutantes IP109, reveló una transversión T to A en el proto-oncogen cmyb. La mutación encontrada produce una sustitución aminoácidica (isoleucina a asparagina) en una zona altamente conservada del dominio de unión al ADN R3. Estos mutantes carecen the timopoiesis, ya que todos las sondas específicas para células T evaludas (rag1, ikaros, ccr9, gata3 and tcrβ) no se manifiestan en la cavidad tímica. Sin embargo, la primera hematopoiesis o hematopoiesis primitiva sólo se ve parcialmente afectada, de acuerdo a la expresión de gata1, cmyb y l-plastin. Del mismo modo, en los embriones mutantes no fue posible detectar la expresión de de tcrβ, ya sea mediante hibridación “in situ” o por RT-PCR. Este último resultado indicaría que la recombinación V(D)J no ocurriría en estos mutantes. Finalmente, con el fin de demostrar que el fenotipo observado era causado por una mutación en el gen que codifica para el proto-oncogen CMyb, se realizó un rescate de la expresión de rag1 en el timo mediante injeccciones de BAC ADN. Los resultados indican que en 12.5% de los embriones injectados (en vez del 25% esperados) no se obtuvo ninguna expresión de rag1 en el timo. De hecho 9 embriones homozygotos mutantes, de acuerdo con la patrón de amplificación de los marcadores ligados a la mutación, recobraron la expresión de rag1 en el timo. Estos resultados suguieren que la injección de BAC ADN pudo recobrar la expression de rag1 en el timo, demostrando así que cmyb es responsable del fenotipo observado.
Finalmente, en este trabajo se caracterizó mediante hibridación “in situ” los embriones mutantes IP045. Con este fin se utilizaron sondas específicas para células T (rag1, ikaros, and tcrβ) y macrófagos (l-plastin). En general, estos mutantes muestran una severa reducción en la timopoiesis. Hasta el momento, la mutación ha sido ligada al cromosoma 8 y el inervalo crítico ha sido definido por maracadores específicos a 6.26 cM.


SWD-Schlagwörter: Thymus , Embryonalentwicklung , Zebrabärbling , Mutante
Freie Schlagwörter (englisch): Thymus , embryonic development , zebrafish , mutant
Institut: Max-Planck-Institut für Immunbiologie
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Boehm, Thomas (Prof. Dr)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 06.03.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 20.02.2009
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