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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-64705
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6470/


Weis, Britta

Etablierung einer Methode zur in-vitro-Analyse des Insertionsmechanismus der ersten und der zweiten Transmembrandomäne von YidC und YidC-delta307 in Escherichia coli

Establishment of a method for in-vitro analysis of the insertion mechanism of the first two transmembrane domains of YidC and YidC-delta307 in Escherichia coli

Dokument1.pdf (4.689 KB) (md5sum: 58c5c5e8fcd50700f4c893578de7917b)

Kurzfassung in Deutsch

Gramnegative Bakterien, wie Escherichia coli, bestehen aus vier Kompartimenten: Cytoplasma, Innenmembran, Periplasma und Außenmembran. Seiner Funktion entsprechend verfügt jedes Kompartiment über eine spezifische Proteinausstattung. Da alle Proteine grundsätzlich im Cytoplasma synthetisiert werden, müssen die Proteine der anderen Kompartimente während bzw. nach ihrer Synthese zu ihrem Zielort transportiert werden. In der Innenmembran befindet sich hierzu vor allem das Sec-Translokon, dessen heterotrimerer Komplex in Zusammenarbeit mit assoziierten Komponenten für die Translokation und Integration von Proteinen zuständig ist. Das Sec-Translokon besitzt eine duale Funktion: Zum einen vermittelt es den Transport sekretorischer Proteine über die Innenmembran, zum anderen die Insertion integraler Proteine in die Membran. Beide Transportwege unterscheiden sich in den Mechanismen von Erkennung, Zielsteuerung an die Membran und Translokation der Substrate:
1) Sekretorische Proteine werden posttranslational in Abhängigkeit von dem Chaperon SecB und der ATPase SecA transportiert. Der Antrieb der Translokation wird von SecA geleistet.
2) Integrale Proteine der Innenmembran werden in Abhängigkeit von SRP und seinem Rezeptor FtsY kotranslational integriert. Der Antrieb der Integration wird wahrscheinlich von der Translation selbst geleistet. Die Transmembrandomänen (TMs) von integralen Membranproteinen verlassen das Sec-Translokon nach lateral und werden in die Lipidschicht der Membran inseriert.
Eine Sonderstellung nehmen Innenmembranproteine mit großen periplasmatischen Domänen ein. Die Translokation dieser ausgeprägten periplasmatischen Schleifen über die Membran benötigt zusätzlich das Motorprotein SecA. Ein Beispiel hierfür ist das Membranprotein YidC, das die Membran sechsmal durchspannt, wobei die erste und die zweite TM durch eine 320 AS lange periplasmatische Schleife verbunden sind. In früheren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die SecA-Abhängigkeit durch die Größe der periplasmatischen Schleife zwischen den ersten beiden TMs von YidC bestimmt wird. Wird diese von 320 AS auf 13 AS reduziert (YidC-delta307), wird für die Insertion in die Membran kein SecA mehr benötigt. Warum die TMs von YidC-delta307 ohne SecA in die Membran integrieren und wie im Fall von YidC SecA mit dem Sec-Translokon interagiert, ist nicht bekannt.
In dieser Arbeit wurde eine Methode etabliert, um diese Fragestellungen anzugehen. Hierzu wurde ein in-vitro-System konstruiert, in dem die zu untersuchenden Proteine – YidC und YidC-delta307 – synthetisiert und in invertierte Innenmembranvesikel (INVs) integriert werden. Durch gezieltes Anhalten der Translation der beiden mRNAs an beliebigen Stellen werden die Substrate in Form von „Ribosomen-assoziierten naszierenden Ketten“ (RNK) unterschiedlicher Länge in das Sec-Translokon eingefädelt, so dass es zur Bildung von stabilen Insertionsintermediaten kommt. Durch den gleichzeitigen ortspezifischen Einbau des Quervernetzers pBpa in die ersten beiden TMs der RNKs von YidC und YidC-delta307 konnte die molekulare Umgebung dieser Regionen während der Insertion detektiert und miteinander verglichen werden. Die bisherigen Quervernetzungsversuche weisen auf deutliche Unterschiede der molekularen Umgebung der genannten Transmembrandomänen während der Insertion hin und validieren somit die experimentelle Vorgehensweise.


Kurzfassung in Englisch

The cytoplasm of Gram-negative bacteria, like Escherichia coli, is surrounded by a cell envelope, which is composed of the inner membrane, the periplasm and the outer membrane. Proteins of these compartments have to be transported specifically to their site of destination after their synthesis.
Besides other transport systems, the inner membrane (IM) contains the so called Sec-translocon. This heterotrimeric complex shows a dual function: on the one hand it is involved in the transport of secretory proteins across the inner membrane and on the other hand it is responsible for the insertion of integral proteins into the inner membrane. The mechanisms of both pathways are different: The transport of secretory proteins across the IM occurs posttranslationally and depends on the motor protein SecA whereas the insertion of integral proteins occurs cotranslationally and is SRP-dependent. Besides these two mechanisms a third one exists: The insertion of integral proteins with large periplasmic loops requires SRP as well as SecA. Recently this dual dependency was demonstrated for YidC, which spans the inner membrane six times and contains a 320 amino acid long periplasmic loop. When the size of the periplasmic loop was reduced down to 13 amino acids (YidC-delta307), the insertion became independent of SecA.
The aim of this diploma thesis is to establish a method in order to investigate the insertion mechanism of the first transmembrane domain (TM) of YidC, which functions as signal anchor sequence and of the second TM, which functions as stop transfer sequence.
This was done separately for wild-type YidC and YidC-delta307 in order to see how SecA might influence the insertion mechanism of both TMs.
In order to analyze the mechanism of insertion crosslinking experiments between in vitro sythesized radiolabeled YidC / YidC-delta307 with engineered crosslinker and the Sec-translocon present in inner membrane vesicles were performed. In order to investigate the molecular neighbourhood of the first two TMs of the substrates, they were synthesized in form of ribosomal nascent chains of a defined length. As a consequence a stable insertion intermediate is formed, whereas the area of interest (first two TMs) is synthesized and can interact with the Sec-translocon. The crosslinker pBpa (p-Benzoyl-phenylalanine) is introduced into YidC via an in vitro system that suppresses amber stop codon mutants of YidC – obtained by mutagenizing PCR – and incorporates the photoreactive derivative of phenylalanine pBpa at the positions of the amber codons. Irradiation with UV light activates the crosslinker, so that it covalently binds to its interaction partner. This partner can be identified by the molecular weight of the complex on SDS-PAGE and by immunoprecipitation.
Former crosslinking experiments show significant differences of the molecular neighbourhood of the mentioned TMs during the insertion and therefore validate the applied method.


SWD-Schlagwörter: Escherichia coli , Proteintransport
Freie Schlagwörter (deutsch): YidC, SecA , Insertionsmechanismus
Freie Schlagwörter (englisch): YidC, SecA , Insertion mechanism
Institut: Inst. für Biochemie und Molekularbiologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Diplomarbeit, Magisterarbeit
Sprache: Deutsch
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 04.05.2009
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