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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-65156
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6515/


Bunjes, Vanessa Josepha

Funktionalisierung liposomaler Drug Carrier Systeme mit Mistellektin I - Verkapselung und aktives Targeting in vitro

Functionalisation of liposomal drug carrier systems with mistletoe lectin I - encapsulation and active targeting in vitro

Dokument1.pdf (2.997 KB) (md5sum: 52a0e93ea796235df43d874a17faa33f)

Kurzfassung in Deutsch

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung eines liposomalen Drug Carrier Systems, mit dem zum einen das Mistellektin-I (ML-I) verkapselt zum Wirkort geschleust und zum anderen die B-Kette dieses Proteins zum aktiven Targeting der Liposomen genutzt werden soll.
Die Liposomen stellen dabei ein geeignetes Vehikel für hydro- als auch lipophile Substanzen dar, da sie einerseits in den hydrophoben Bilayer eingelagert, andererseits in den wässrigen Innenraum verkapselt werden können, um diese vor dem Immunsystem zu schützen. Beim Mistellektin-I handelt es sich um ein RIP Typ 2 Protein, welches aus einer A- und einer B-Kette aufgebaut ist. Die A-Kette stellt die zytotoxische Komponente dar, in dem es die Proteinsynthese am Ribosom unterbindet, was schließlich zur Apoptose führt. Die B-Kette hingegen nimmt Kontakt zu Galaktose- sowie α2,6-sialyierten Neolakto-Gangliosid-Resten auf der Zelloberfläche auf. Angenommen wird eine endozytotische Aufnahme des Moleküls in die Zelle.
Zunächst wurden die ML-I-Liposomen nach verschiedenen Verfahren hergestellt, um jenes mit der höchsten Einschlusseffizienz (EE) des ML-I auszuwählen. Durch Nutzung der Detergensdialyse konnte eine ausreichende EE (8 µg/ml) erreicht werden. Der EC50-Wert auf MOLT4-Zellen (T-Zell-Leukämiezelllinie) des verkapselten ML-I war vergleichbar mit dem des freien ML-I, wobei die Apoptoserate verstärkt ausgelöst wurde und die Nekroserate abnahm. Die apoptotische bzw. nekrotische Wirkung des verkapselten Proteins ist jedoch im Vergleich zum freien ML-I geringer.
Eine schnellere und erhöhte Aufnahme von Liposomen in Zellen sollte durch die Funktionalisierung mittels B-Kette des ML-I erreicht werden. Dazu wurde zunächst ein Maleinimidgruppen-spezifischer PEG-Cholesterol-Anker (MPC, PEG = Polyethylenglykol) nach Optimierung einer Anleitung von Pan et al. 2007 synthetisiert. Die B-Kette wurde isoliert und konnte durch einen neuen adsortiven Aufreinigungsschritt mit einer Ausbeute von ca. 25 % und einer Reinheit von 97–99 % gewonnen werden.
Die Kopplung an die liposomale Oberfläche wurde mittels SPIT (Sterol-based Post-Insertion Technique) durchgeführt, wobei die B-Kette zunächst über Nacht mit dem MPC-Anker inkubiert und anschließend das Konjugat in vorgefertigte Liposomen insertiert wurde (30 min). Die Kopplung wurde mittels radioaktiver 125Iod-Markierung der B-Kette verfolgt. Die maximale Kopplungseffizienz (KE) lag mit ca. 15 % bei einem Anker zu Protein-Verhältnis von 150:1 (mol/mol). Im Vergleich dazu wurden Versuche mit dem konventionell verwendeten Mal-PEG-DSPE-Anker (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[maleinimido-poly(ethylen¬glykol)-2000]) durchgeführt. Die Kopplung der B-Kette erfolgte mit Hilfe der in der Literatur beschriebenen PIT (Post-insertion Technique) bzw. des Einbaus während der Liposomenpräparation (Conventional Method). Die KE war bei der neuen SPIT vergleichbar zu den herkömmlichen Methoden. Die B-Kette war zudem stabil in der Membran verankert und ließ sich nicht durch Serumproteine desorbieren. Eine nachträgliche Funktionalisierung von Stealth®-Liposomen (PEG-modifizierten Liposomen) mit dem Konjugat war ebenfalls möglich.
Zum aktiven Targeting wurden MOLT4-Zellen als Leukämie-Modell mit den B-Ketten-funktionalisierten Liposomen (2 oder 5 mol% PEG-Chol- oder PEG-DSPE-Konjugat) für 2 Stunden inkubiert. Mittels FACS Analyse konnte keine vermehrte Aufnahme festgestellt werden, was zunächst durch ein zu schwaches Endozytosesignal der B-Kette für das Liposom gedeutet wird. Dies wird in Folgearbeiten näher zu untersuchen sein.


Kurzfassung in Englisch

The main part of the present work is the development of a liposomal drug carrier system with which on the one hand incorporated mistletoe lectin-I (ML-I) is delivered to the target tissue and on the other the B-chain of the protein is used for active targeting of liposomes to tumor cells.
Liposomes are convenient vesicles for lipophilic as well as for hydrophilic drugs, which are either incorporated in the hydrophobic bilayer or encapsulated in the aqueous interior for shielding them from the immune system.
Misteltoe lectin-I is a RIP type 2 protein which consists of an A- and a B-chain. The A-chain represents the cytotoxic component by inhibiting ribosomal protein synthesis which finally ends in apoptosis. On the contrary the B-chain contacts galactose and α2,6-sialo- neolactoganglioside reidues on cell surfaces. An endocytotic uptake is expected.
First, ML-I-liposomes were prepared using different methods for selecting the one with the highest encapsulation efficiency (EE) of the protein. By using detergent removal, an adequate EE (8 µg/ml) could be achieved. The EC50-value of MOLT4 cells (T-cell leukemia cells) of the encapsulated ML-I was comparable to that of free ML-I, whereas apoptosis was increased while necrosis was decreased. However, both the apoptotic and necrotic rate of the incorporated protein were less compared to the free ML-I.
Second, a faster and higher liposomale uptake into cells should be achieved by functionalisation using the B-chain of ML-I. For this purpose, a maleimido specific PEG-cholesterol anchor was synthesized (MPC; PEG = polyethyleneglycol) optimizing the instructions of Pan et al. 2007. The B-chain was isolated and gained by absorbic purification step yielding about 25 % pure chain (97-99 %).
For coupling on the liposomale surface, the SPIT (sterol-based post insertion technique) was used, which has been developed in our group. Following this protocol, the B-chain was incubated with the MPC anchor over night and subsequently inserted into preformed liposomes (30 min). Experiments were tracked by radiolabelling the B-chain using 125iodide. The maximal coupling efficiency achieved was 15 % with an anchor to protein ratio of 150:1 (mol/mol). In comparison, experiments were performed using the commercial Mal-PEG-DSPE anchor (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleinimido-poly-(ethylen¬glycol)-2000]). In this case the coupling procedure was carried out by means of PIT (post-insertion technique) and CM (conventional method) as described in literature.
In summary, the coupling efficiency using SPIT was equivalent to conventional methods. Furthermore the B-chain was anchored stably into the liposomale membrane and was not desorbed by serum proteins. Furthermore, additional functionalisation of Stealth® liposomes (PEG modified liposomes) with the conjugat was possible as well.
For active targeting, MOLT4 cells, as a leukaemia model, were incubated with B-chain functionalised liposomes (2 and 5 mol% PEG-Cholesterol and PEG-DSPE conjugate) for 2 hours. Determination was done by means of flow cytometry showing no significant increase in cellular uptake, which can be explained by a weak endocytotic signal of the B-chain for the liposomes. Further studies have to be carried out to improve the endocytotic pathway of the liposomes.


SWD-Schlagwörter: Liposom
Freie Schlagwörter (deutsch): Mistellektin 1 , PEG-Cholesterol , B-Kette , Aktives Targeting
Freie Schlagwörter (englisch): liposome , mistletoe lectin 1 , PEG-cholesterol , B-chain , active targeting
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Schubert, Rolf (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 05.05.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 13.05.2009
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