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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-65217
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6521/


Maaß, Dirk Peter Walter

Hyperakkumulation von Carotinoiden in Arabidopsis : Zur posttranskriptionalen Regulation der Phytoensynthase

Hyperaccumulation of carotenoids in Arabidopsis : towards the posttranscriptional regulation of phytoene synthase

Dokument1.pdf (5.858 KB) (md5sum: e5f1e3b3b5f16a8e31130e95cc0baa70)

Kurzfassung in Deutsch

Ausgangssituation der vorliegenden Doktorarbeit waren Arabidopis-Linien, die den kodierenden Bereich der Phytoensynthase aus Arabidopsis (AtPSY) als C-terminale Fusion mit dem FLAG-Tag unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors überexprimierten (AtPSY-FLAG, 35S::5’UTR280-AtPSY-FLAG-Linien). Kallusgewebe, das aus diesen Linien generiert wurde, zeigte einen stark erhöhten Carotinoidgehalt, hauptsächlich bestehend aus b-Carotin und Phytoen und Phytofluen. Dieser Phänotyp war in AtPSY-überexprimierenden Linien (35S::5’UTR330-AtPSY-3’UTR-Linien) nicht zu beobachten. Die beiden verwendeten DNA-Konstrukte unterschieden sich nicht nur in der Addition des FLAG-Tags, der enzymologischen Analysen zu Folge als Auslöser für den gesteigerten Carotinoidgehalt in Frage kam. Auch Unterschiede hinsichtlich des AtPSY 5’UTRs (330 versus 280 nt) sowie die Anwesenheit des 3’UTRs könnten durch Auswirkungen auf die AtPSY-Proteinmenge den erhöhten Carotinoidgehalt erklären.
Ziel dieser Dissertation war es, den einzelnen Möglichkeiten nachzugehen und den molekularen Hintergrund der beobachteten Steigerung des Carotinoidgehalt zu bestimmen.
Die AtPSY-Proteinmengen in transgenen Kalli mit vergleichbaren AtPSY-Transkriptmengen wurden mit Hilfe von Western-Blot-Analysen untersucht und mit dem Carotinoidgehalt korreliert. Hierbei konnte sowohl die C-terminale Addition des FLAG-Peptids als auch der 3’UTR als Auslöser für die Carotinoidakkumulation ausgeschlossen werden. Als Ursache für die beobachtete Carotinoidsteigerung in den 35S::5’UTR280-AtPSY-FLAG Linien konnte die Aufhebung einer Translationsinhibition, die über 330 nt des AtPSY 5’UTRs vermittelt wird, festgestellt werden. Eine Verkürzung um 50 nt oder Deletion des kompletten AtPSY 5’UTRs führte gleichermaßen zu einer Steigerung der AtPSY-Proteinmengen bei Linien mit vergleichbaren AtPSY-mRNA-Leveln. In Kallusgewebe translationsinhibierender Linien (enthalten 330 nt des 5’UTRs) wurde eine moderate (ca. 10- bis 14-fache) Erhöhung des AtPSY-Proteingehalts im Vergleich zum Wildtyp nachgewiesen, die nahezu keine Auswirkung auf den Carotinoidgehalt hatte. Dies wurde nur bei nicht-translationsibinhibierenden Linien beobachtet, bei denen die enorme Steigerung im AtPSY-Proteingehalt (ca. 40- bis -50-fach im Vergleich zum Wildtyp) mit dem hohen Carotinoidgehalt korrelierte.
Die translationsinhibierende Wirkung des AtPSY 5’UTRs war in Keimlingen der transgenen Linien ebenfalls zu beobachten. Hier erreichten Linien mit Translationsinhibition den AtPSY-Proteingehalt des Wildtyps, während nur in Linien ohne Translationsinhibition Steigerungen festgestellt wurden. Dies führte in Keimlingen, im Gegensatz zum Kallusgewebe, allerdings nicht zu einer Veränderung des Carotinoidgehaltes, was auf zusätzliche regulatorische Mechanismen im grünen Gewebe hinweist.
Die translationsinhibierende Wirkung des AtPSY 5’UTRs und die Aufhebung der Inhibition durch Verkürzung auf 280 nt konnte in vitro in Weizenkeimlysat bestätigten werden. In Retikulozytenlysat hingegen wurde keine Translationsinhibition festgestellt, was auf einen Pflanzen-spezifischen Mechanismus hinwies. Die mögliche Beteiligung einer Metaboliten-induzierte RNA-Konformationsänderung (Riboswitch) an der Translationskontrolle wurde mit Hilfe des Programms paRNAss untersucht. Diese bioinformatische Analysen wiesen auf die Präsenz energetisch getrennter RNA-Konformationen im translationsinhibitorischen 5’UTR hin, die nach Verkürzung des 5’UTR330 um 50 nt nicht mehr vorhanden waren und somit die beobachtete Inhibition in vivo und in vitro erklären konnte. Diese Ergebnisse bedürfen allerdings noch weiterer experimenteller Bestätigung.
Durch Norflurazon-Versuche konnte eine Beteiligung von Carotinoid-Spaltprodukten als Liganden eines Riboswitches zumindest in Kallusgewebe ausgeschlossen werden, da das AtPSY-Transkript/Protein-Verhältnis von einer Hemmung der Carotinoidbiosynthese unbeeinflusst blieb. Hierbei wurde jedoch festgestellt, dass die Carotinoidbiosynthesekapazität wesentlich höher zu sein scheint als es der Carotinoidgehalt unbehandelter SDC widerspiegelt. Dies impliziert, dass eine Carotinoidakkumulation in Kalli, neben der Translationsinhibition der AtPSY, über den Abbau von Carotinoiden bestimmt wird. Eine stark erhöhte Biosynthesekapazität, wie in Linien ohne Translationsinhibition beobachtet, wird offenbar nicht mehr durch den Carotinoid-Katabolismus kompensiert und führt dann zur Akkumulation von Carotinoiden in Form von Kristallen.
Diese Carotinoid-Kristallbildung wurde durch mikroskopische Analysen in Protoplasten von AtPSY-überexprimierenden SDC nachgewiesen. Dies impliziert, dass eine Carotinoid-Kristallbildung nur durch Überexpression des geschwindigkeitsbestimmenden Schrittes des Biosyntheseweges, der PSY, stattfinden kann und nicht notwendigerweise eines komplexen Plastiden-Differenzierungsprogramms bedarf.


Kurzfassung in Englisch

The starting point of this dissertation has been Arabidopsis lines which overexpressed the coding region of phytoene synthase from Arabidopsis (AtPSY) as C-terminal fusion with the FLAG tag under control of the CaMV promoter (AtPSY-FLAG; 35S::5’UTR280-AtPSY-FLAG lines). Callus tissues generated from these lines showed a strongly increased carotenoid content, consisting of mainly -carotin, phytoene and phytofluene. This phenotype was not observed in AtPSY-overexpressing lines (35S::5’UTR330-AtPSY-3’UTR). The transgene transcripts generated in these two transformations showed differences considering the addition of the FLAG tag, the length of the AtPSY 5’UTRs (330 nt versus 280 nt) and the presence of the AtPSY 3’UTR. The differences in carotenoid accumulation observed with these transformations could be explained both by the C-terminal FLAG tag (by possibly increased enzymatic activity of AtPSY-FLAG) as well as by the differences in 5’ and 3’UTRs (by possibly increased translation efficiency and/or transcript stability). The aim of this dissertation was to distinguish between these possibilities and to determine the molecular reason for the observed carotenoid increase.
AtPSY protein amounts were determined by western blot analyses and compared with carotenoid amounts in callus tissues with comparable AtPSY transcript levels. The results led to exclude the C-terminal FLAG modification as well as the 3’UTR as the reason for the carotenoid accumulation observed. As the cause for the strongly increased carotenoid content observed in 35S::5’UTR280-AtPSY-FLAG-lines we identified the removal of a translation inhibiting effect which is present within 330 nt of the AtPSY 5’UTR. The truncation by 50 nt or the deletion of the complete 5’UTR resulted in similarly increased AtPSY protein amounts in the corresponding transgenic lines. Callus tissue of translation inhibiting lines (containing 330 nt of the AtPSY 5’UTR) showed a moderate increase (10 to 14 fold) in AtPSY protein levels compared with wild type calli, however, with almost no impact on carotenoid content. Only lines without translation inhibition (containing no or 280 nt of the AtPSY 5’UTR) showed a strong increase in AtPSY protein levels (40 to 50 fold) correlating with strongly increased carotenoid content.
The translation inhibiting effect of the AtPSY 5’UTR was present also in seedlings of the corresponding transgenic lines. Seedlings from translation inhibiting lines showed AtPSY protein amounts comparable with wild type seedlings while only seedlings from lines without translation inhibition showed increased AtPSY protein amounts. However, in contrast to callus tissues, these increased AtPSY protein amounts did not result in increased carotenoid contents, indicating additional regulative mechanisms in photosynthetically active tissue.
The translation inhibiting effect of the AtPSY 5’UTR was confirmed in vitro using wheat germ lysate. In contrast, in rabbit reticulocyte lysate, no translation inhibition was observed. The possible involvement of a metabolite-induced change in RNA conformation in translation control (riboswitch) was investigated using the paRNAss software. This bioinformatic analysis indicated the presence of energetically separated RNA conformations in the translation inhibiting AtPSY 5’UTR. Interestingly, these conformations were absent if the 5’UTR330 was truncated by 50 nt. These results imply that the inhibiting effect mediated by the AtPSY 5’UTR observed in vitro and in vivo is due to a riboswitch mechanism, however, these findings require further investigations. Experiments in callus tissue treated with the carotenoid biosynthesis inhibitor norflurazone excluded for the involvement of carotenoid cleavage products representing ligands involved in the translational inhibition, as AtPSY transcript to AtPSY protein ratios remained unaffected by this treatment.
Interestingly, however, norflurazone experiments indicated that the carotenoid biosynthesis capacity in calli is significantly higher than it was concluded from untreated calli. These data provide evidence that the carotenoid accumulation in calli is governed by carotenoid degradation. As an explanation, the strong increase in carotenoid biosynthesis capacity, present in lines without translation inhibition, could not be compensated by carotenoid catabolism and resulted in the accumulation of carotenoids sequestered as carotenoid crystals. These carotenoid crystals have been detected by light and polarization microscopy in protoplasts of AtPSY-overexpressing calli. This sequestration type could thereby simultaneously contribute to the accumulation as carotenoids get inaccessible for the catabolic pathway when deposited within crystals. The results imply that carotenoid crystal formation can be induced by the overexpression of the rate-limiting step of the carotenoid biosynthesis pathway, PSY, without the need for complex plastid differentiation programs.


SWD-Schlagwörter: Carotinoide , Ackerschmalwand , Immunoblot , Callus , Isoprenoide
Freie Schlagwörter (deutsch): Phytoensynthase , UTR, Carotinoidkristalle , Riboswitch , in vitro Translation
Freie Schlagwörter (englisch): phytoene synthase , UTR, carotenoid crystal , riboswitch , in vitro translation
Institut: Institut für Biologie 2
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Beyer, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.04.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 19.05.2009
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