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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-65272
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6527/


Erb, Annette

Untersuchungen zur Biosynthese von Oligosaccharid-Antibiotika aus Actinomyceten

Investigations on the biosynthesis of oligosaccharide antibiotics

Dokument1.pdf (16.971 KB) (md5sum: 801e560bffef81ca22a32894fab51a60)

Kurzfassung in Deutsch

A. Der Actinomycet Micromonospora sp. Tü 6368 produziert die Polyketide Saquayamycin Z und Galtamycin B, bei denen es sich um Abkömmlinge des PKS II-Stoffwechsels mit neun beziehungsweise vier Desoxyzuckern handelt. Beide Substanzen werden von einem gemeinsamen Biosynthesegencluster produziert, das in dieser Arbeit identifiziert und annotiert werden konnte. 31 offene Leserahmen sind vermutlich an der Biosynthese beteiligt, darunter sechs Glykosyltransferasegene, saqGT1 – saqGT6. Die Funktionen der einzelnen Glykosyltransferasen wurden durch Inaktivierungs- und Expressionsexperimente aufgeklärt. Diese geben einen detaillierten Einblick in den Aufbau der Zuckerketten von Saquayamycin Z und Galtamycin B. Besonders hervorzuheben sind
die Glykosyltransferasen SaqGT5, die eine stabile C-C-Verknüpfung zwischen Aglykon und Desoxyzucker aufbaut, SaqGT2, welche eine neue Substrat-Akzeptorspezifität aufweist und SaqGT6, die eine ungewöhnliche 4→1-Verknüpfung zwischen zwei Desoxyzuckern generiert.
B. Das von dem Actinomyceten Saccharothrix espanaensis gebildete Oligosaccharid-Antibiotikum Saccharomicin besteht aus 17 Desoxyzuckern und einem Kaffeesäure-Aglykon, das mit Taurin verbunden ist. Die Inaktivierung zweier Glykosyltransferasegene des Biosynthesegenclusters, sam19 und sam20, führte zu einer verringerten Bioaktivität gegenüber Bacillus subtilis, was zeigt, dass die Zucker zur antibiotischen Aktivität von Saccharomicin beitragen.
C. Die Rhodinosyltransferase LanGT4 katalysiert in der Biosynthese der Hexasaccharid-Kette von Landomycin A die Übertragung von zwei Zuckern. LndGT4 ist ebenfalls eine Rhodinosyltransferase, die mehr als 70 % identische Aminosäuren zu LanGT4 aufweist. LndGT4 ist an der Biosynthese von Landomycin E, einem Naturstoff mit nur drei Zuckern, beteiligt. Dort überträgt LndGT4 lediglich einen Zucker. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass LndGT4 überraschenderweise ebenfalls eine iterative Fähigkeit besitzt, obwohl diese
Bifunktionalität in der Landomycin E-Biosynthese nicht notwendig ist.
D. Sequenzspezifische Rekombinasen wie Cre, Flp and Dre sind wichtige Werkzeuge in der Genetik. Ihre Anwendung in Actinomyceten ist jedoch aufgrund des hohen G/C-Gehaltes und einem daraus resultierenden unterschiedlichen Codon-Gebrauch dieser Bakterien nicht praktikabel. Eine synthetisch hergestellte Cre-Rekombinase, deren Codon-Gebrauch dem von Actinomyceten angepasst wurde, war funktional in Micromonospora sp. Tü 6368. Ein von loxP-Erkennungssequenzen flankiertes Resistenzgen konnte spezifisch und mit 100 % Effizienz aus dem Chromosom von Micromonospora sp. Tü 6368 entfernt werden.


Kurzfassung in Englisch

A. Saquayamycin Z and galtamycin B are produced by the actinomycete Micromonospora sp. Tü 6368. They are polyketides derived from the PKS II pathway and contain nine and four deoxysugars, respectively. The biosynthetic gene cluster of these compounds was identified and annotated, resulting in 31 open reading frames on 36.6 kb probably involved in biosynthesis. Those include six glycosyltransferase genes, saqGT1 – saqGT6. By inactivation and heterologous expression experiments the function of the glycosyltransferases SaqGT1-3 and SaqGT5-6 were elucidated, leading to a complete model for the assembly of the sugar chains in saquayamycin Z and galtamycin B biosynthesis. In particular, SaqGT5 acts as first glycosyltransferase, establishing a stable
carbon-to-carbon linkage between the aglycon and the first deoxysugar. SaqGT2 was shown to be a glycosyltransferase with a new position of transfer and SaqGT6 generates an unusual 4→1 linkage between two deoxysugars.
B. The oligosaccharide antibiotic saccharomicin produced by Saccharothrix espanaensis consists of 17 deoxysugars and a caffeic acid aglycon which is attached to taurine. The inactivation of two glycosyltransferases, sam19 and sam20, resulted in a decreased activity against Bacillus subtilis compared to the wild type. This indicated that the sugars contribute to the antibiotic activity of saccharomicin.
C. LanGT4 is a well-studied glycosyltranserase that attaches two L-rhodinoses during the biosynthesis of landomycin A that contains six deoxysugars. LndGT4 is another rhodinosyltransferase that shares over 70 % identical amino acids with LanGT4 and is involved in landomycin E biosynthesis which contains three deoxysugars. LndGT4 transfers only one sugar under native conditions. It was shown that LndGT4 – like its analogue LanGT4 – has the ability to work twice which was surprising as the iterative function is not required for landomycin E biosynthesis.
D. Site specific recombinases such as Cre, Flp and Dre are important tools in genetic engineering. Their application in actinomycetes remained difficult due to the high G/C content and therefore different codon usage of these bacteria. We have constructed a synthetic gene encoding Cre recombinase whose G/C content has been adapted to that of actinomycetes. This gene was demonstrated to be functional in Micromonospora sp. Tü 6368. A resistance gene flanked by loxP sites was removed specifically and with 100 % efficiency from the chromosome of Micromonospora sp. Tü 6368.


SWD-Schlagwörter: Molekularbiologie
Freie Schlagwörter (deutsch): Actinomyceten , Glykosyltransferase , Oligosaccharid-Antibiotika
Freie Schlagwörter (englisch): glycosyltransferase , actinomycetes
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Bechthold, Andreas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 05.05.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 26.05.2009
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