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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-65697
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6569/


Kurutsch, Anja

Shikimatbiosyntheseweg : mikrobielle Produktgewinnung der Metabolite Chorismat und SHCHC und Einsatz des Enzyms MenD als Biokatalysator für asymmetrische C-C-Bindungsknüpfung

Shikimate pathway: microbiological production of the metabolites chorismate and SHCHC and investigation of the biocatalytic potential of MenD for asymmetric C-C-bond formation

Dokument1.pdf (2.667 KB) (md5sum: 26e19aa52e298fcdc27775cdc974f6f0)

Kurzfassung in Deutsch

Chiralität ist eine der wesentlichen Eigenschaften von vielen bioaktiven Stoffen. In diesem Zusammenhang erlangt die stereoselektive Synthese eines bestimmten Enantiomeres einer Substanz immense Bedeutung. Denn oftmals ist nur ein Enantiomer wirksam, während das andere inaktiv ist, oder sich sogar als toxisch herausstellt.
In dieser Arbeit wurden die chiralen Naturstoffe Chorismat und 2-Succinyl-6-hydroxy-2,4-cyclohexadiene-1-carboxylat (SHCHC) als Synthesebausteine verfügbar gemacht sowie die Enzyme Isochorismat Synthase (EntC) und 2-Succinyl-5-enolpyruvyl-6-hydroxy-3-cyclohexen-1-carboxylat Synthase (MenD) aus dem Shikimisäure-Biosyntheseweg auf ihre Eignung als Biokatalysatoren zur asymmetrischen Synthese untersucht.
Chorismat und SHCHC wurden durch "Metabolic Engineering" veränderter E. coli Stämme produziert, gereinigt, isoliert und charakterisiert.
Die Enzyme EntC und MenD wurden mit His-tag kloniert und stehen aufgereinigt zum Einsatz als Biokatalysatoren zu Verfügung.
Das thiamindiphosphat-abhängige Enzym MenD aus E. coli wurde dabei eingehend auf un¬physio¬logische C-C-Bindungsknüpfungsreaktionen untersucht.
α-Ketoglutarat wird nach erfolgter Decarboxylierung mit Hilfe des Cofaktors umgepolt und reagiert als (Elektronen-)Donor mit einem breiten Spektrum von Aldehyden (Akzeptoren). Aus diesen Carboligationen resultierten chirale α-Hydroxyketone mit isolierten Ausbeuten von 26-87%. Mit aromatischen Aldehyden konnten darüber hinaus hohe Enantio¬meren¬überschüsse von bis zu 98% erreicht werden.
Charakteristisch für die durch MenD-Katalyse gebildeten Produkte ist eine hohe, konservierte Regioselektivität.
α-Ketoglutarat fungiert gewöhnlich als Donor und es entstehen durch Addition an Aldehyde 5-Hydroxy-4-oxopentansäurederivate. Die einzige bislang beobachtete Ausnahme stellt die Carboligation zwischen den zwei Ketosäuren Pyruvat und α-Ketoglutarat dar. Bei dieser Reaktion kehrt sich die Regioselektivität um und es entsteht racemisches 4-Hydroxy-5-oxohexanoat.
Der Donor α-Ketoglutarat kann wie der Akzeptor ebenfalls ausgetauscht werden. Kleinere Donoren wie Oxalacetat und Pyruvat werden von MenD prinzipiell akzeptiert, jedoch mit deutlich geringeren Umsätzen.
Die physiologische 1,4-Addition von α-Ketoglutarat an die ungesättigte Carbonsäure Isochorismat wurde im Hinblick auf die Substratbreite untersucht. Das durch mikrobielle Fermentation erhältliche 2,3-Dihydroxy-cyclohexa-4,6-diencarboxylat (2,3-CHD) ist das einzige bisher bekannte, nicht-physiologische Substrat, das in einer 1,4-Addition von MenD umgesetzt wird. (5S,6S)-2-Succinyl-5,6-dihydroxycyclohex-2-encarboxylat (SDHCHC) konnte dabei als nicht-physiologisches 1,4-Addukt identifiziert werden. Im Gegensatz zur 1,2-Additon ist das Spektrum der Substrate, die in 1,4-Addition reagieren, sehr eingeschränkt. Die Testung einer Reihe weiterer ungesättigter Carbonsäuren, sowie Carbonsäureestern und Ketone ergab keinen Hinweis auf katalytischen Umsatz durch das Enzym MenD.
MenD bietet mit seinem breiten Substratspektrum, sowie der Eigenschaft zwei unter¬schiedliche Reaktionstypen zu katalysieren, großes Potential als Biokatalysator in der enzymatischen Synthese.
Zusammen mit den fermentativ im Grammmaßstab zugänglichen Naturstoffen Chorismat und SHCHC stehen nun bislang nicht zugängliche, chirale Substanzen als interessante Bausteine zur Synthese von pharmakologisch aktiven Substanzen zur Verfügung.


Kurzfassung in Englisch

Since many pharmaceutical compounds are chiral, and mostly only one enantiomer is active and in addition the other can be toxic, chiral building blocks are interesting starting points for the synthesis of chiral pharmaceuticals.
Aim of the work was to generate the chiral products Chorismat und 2-Succinyl-6-hydroxy-2,4-cyclohexadiene-1-carboxylate (SHCHC) using metabolites and the enzymatic equipment of the shikimate pathway. In addition two enzymes, the Isochorismate Synthase (EntC) and the 2-Succinyl-5-enolpyruvyl-6-hydroxy-3-cyclohexen-1-carboxylate Synthase (MenD) were investigated regarding their biocatalytic potential.
Overproduction in engineered E. coli, isolation and a purification process is developed for chorismate and SHCHC. The stereochemical information of these natural metabolites will be used to generate new chiral building blocks by subsequent chemical synthesis.
EntC and the thiamine diphosphate (ThDP)-dependent enzyme MenD from E.coli, formerly known as SHCHC-synthase, were cloned including a His-tag and purified for further biocatalytic studies.
MenD catalyzes the decarboxylation of α-ketoglutarate and the subsequent addition of the resulting succinyl-THDP to isochorismate. Here, the enzyme is tested for unphysiologial C-C-bond forming reactions. Condensation of α-ketoglutarate after decarboxylation to a broad range of aldehydes gave α-hydroxyketones with isolated yields from 26-87% and up to 98% ee for addition to aromatic aldehydes. MenD accepts a wide range of aldehydes as acceptor substrates to produce chiral α-hydroxyketones with conserved regioselectivity where the activated succinylsemialdehyde serves selectively as the donor. Regioselectivity is inverted only for condensation of α-ketoglutarate with pyruvate (activated acetaldehyde) as donor. Besides α-ketoglutarate, pyruvate and oxalacetate are accepted as donors in combination with benzaldehyde and 2-fluorobenzaldehyde as acceptors, however with decreased activity of C-C bond formation.
The physiological 1,4-addition of α-ketoglutarate to isochorismate was investigated for acceptor substrate variability. 2,3-Dihydroxy-cyclohexa-4,6-dienecarboxylate (2,3-CHD), which lacks the pyruvyl found in isochorismate, is converted to (5S,6S)-2-succinyl-5,6-dihydroxycyclohex-2-enecarboxylate. In contrast to the addition to carbonyls, the active site of MenD does appear to impose specific constraints on the acceptor substrate for 1,4-addition with α,β-unsaturated carboxylic acids.
Together with the substrates gained by overproduction in engineered E. coli, a broad variety of new chiral building blocks with considerable potential as pharmacological precursors are now available.


SWD-Schlagwörter: Biokatalyse , Enzym
Freie Schlagwörter (deutsch): Chorismat SHCHC MenD ThDP Biokatalyse
Freie Schlagwörter (englisch): Chorimate SHCHC MenD ThDP Biocatalysis
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Müller, Michael (Prof. Dr.)
Quelle: A. Kurutsch, M.Richter, V. Brecht, G.A. Sprenger, M. Müller; MenD as catalyst for asymmetric chemical synthesis, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 23.03.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 26.06.2009
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