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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-66374
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6637/


Misiek, Mathias

Untersuchung der Armillylorsellinat-Biosynthese aus dem Phytopathogen Armillaria mellea zur einfachen Evaluation seiner Virulenz

Biosynthetic studies on secondary metabolites from the plant pathogenic fungus Armillaria mellea

Dokument1.pdf (5.010 KB) (md5sum: 00fc593204f6dd76499381d2490225b3)

Kurzfassung in Deutsch

Pilzarten der pflanzenpathogenen Basidiomyceten-Gattung Armillaria (Hallimasch) produzieren kleine hochaktive Naturstoffe, die Armillylorsellinate. Das gemeinsame Strukturelement dieser Sekundärstoffe ist stets ein Protoilludan-Sesquiterpenalkohol, welcher mit einem Orsellinsäurederivat verestert ist. Basidiomyceten waren bezüglich ihrer Sekundärstoffgene und -enzyme weitestgehend unerforscht. Zur Aufklärung der Biosynthese von Armillylorsellinaten wurden in der vorliegenden Arbeit folgende Experimente durchgeführt:
A) Erstellung einer genomischen Cosmidbank von Armillaria mellea mit über 12000 Cosmidklonen. DNA-Sonden auf flavinabhängige Halogenasen und nicht-reduzierende pilzliche Polyketidsynthasen (PKS) brachten hieraus zwei nicht überlappende Sequenzabschnitte von 90 kb und 36 kb hervor. Die Sonde für PKS war speziell für Basidiomyceten entwickelt worden, da diese sich signifikant von allen bisher bekannten PKS aus Pilzen unterscheiden. Aus Sequenzanalysen konnten dabei die folgenden, zur Naturstoff-Biosynthese relevanten Gene identifiziert werden: zwei Halogenase-Gene, ein PKS-Gen, ein NRPS-Gen, das Gen eines Transkriptionsregulators mit drei DNABindedomänen, sowie drei Effluxpumpen-Gene zur Ausschleusung kleiner Metabolite. Desweiteren war hieraus ersichtlich, dass Armillaria seine Gene zur Sekundärstoffbiosynthese, im Gegensatz zu anderen Pilzen und Prokaryoten, sehr wahrscheinlich nicht in geclusterter Form organisiert.
B) Aus Transkriptionsanalysen von sieben dieser Gene konnten 150 Exon/Introngrenzen verifiziert werden. Erstmals konnten hierbei auch das Auftreten von variablen Donor/Akzeptorstellen, sowie selektives allel-spezifisches Spleißen in Homobasidiomyceten beobachtet werden.
C) Für die weitere Untersuchungen in vitro konnten drei Gene armH1, armH2 und armA als 6xHistidin-Fusionsproteine heterolog in E.coli exprimiert und aufgereinigt werden. Mit Aspergillus nidulans wurde für ArmA, die nichtribosomale Peptidsynthethase, ein gänzlich neuartiges Expressionssystem für Naturstoffgene eingesetzt. Mit dem rekombinanten Protein ArmAHisTag, konnte nachfolgend erfolgreich eine in vitro Umsetzung durchgeführt werden.
D) Durch eine Optimierung von Medien und Kulturbedingungen konnte die Sekundärstoffproduktion von Armillaria erheblich beschleunigt und verbessert werden. Über Produktionsanalysen wurde gezeigt, dass neben den zehn bekannten nordamerikanischen Armillaria-Arten auch haploide Armillaria-Kulturen in der Lage sind Armillylorsellinate zu synthetisieren. Von allen zehn nordamerikanischen Armillaria-Arten wurden chemische Profile über ihre Sekundärstoffproduktion erstellt.
E) Im Rahmen dieser Arbeit wurden in etwa 40 neue Naturstoffe der Armillylorsellinat-gruppe entdeckt. Eines dieser Derivate (Arnamial) wurde hierbei vollständig chemisch-spektroskopisch charakterisiert.
F) Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass einzelne Armillylorsellinate neben ihrer antifungalen Wirkung auch starke zytotoxische Eigenschaften gegenüber verschiedenen Tumorzellen zeigen. Der apoptotische Zelltod erfolgt hierbei Caspase-3 vermittelt.


Kurzfassung in Englisch

The plant pathogenic fungus Armillaria produces small active secondary metabolites called armillylorsellinates. Till this day the genetic background of secondary metabolite production in basidiomycetes is completely unexplored. To elucidate the genetics behind the secondary metabolism of Armillaria following experiments have been carried out:
A) Construction and screening of an Armillaria cosmid library for flavin-dependant halogenases and basidiomycetous polyketidsynthases. The investigated reading frames show significant homologies to: FAD-halogenase genes, polyketide synthase genes, nonribosomal peptide synthetase genes, transcriptional regulator genes and small molecule efflux transporter genes.
B) Experimental analysis of in silico predicted intron/exon junctions for accuracy. Validation of noncanonical splice sites, introns with alternative donor or acceptor junctions, and alleleselective splicing.
C) Heterologous expression in E.coli and Aspergillus nidulans and 6xHistidin-based protein purification of three Armillaria genes. In-vitro function verification of armA as a nonribosomal peptide synthetase.
D) Optimization of secondary metabolite production in Armillaria. Proof of secondary metabolite production in haploid armillaria species as well as in all north-american armillaria species.
E) Identification of 40 new metabolites of the armillylorsellinate group. Chemical and spectroscopic structure elucidation of arnamial as a new and formerly unknown metabolite.
F) Description of antifungal and cytotoxic activity of selected armillylorsellinates. Increased activity of Caspase-3 after exposure of Jurkat cells to Arnamial points out a preliminary structure-activity relationship for sesquiterpene aryl esters.


SWD-Schlagwörter: Hallimasch , Sekundärmetabolit
Freie Schlagwörter (englisch): armillaria, metabolite
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Bechthold, Andreas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.06.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 08.07.2009
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