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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-67455
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6745/


Theobald, Alice Susanne

Laurdan als Fluoreszenzsonde zur Quantifizierung der Wechselwirkung von Gallensalzen mit Liposomenmembranen

Laurdan as fluorescence probe to quantify the interaction of bile salts with liposomal membranes

Dokument1.pdf (8.700 KB) (md5sum: 6595eeda68a17c3ca8037509f4e40e9e)

Kurzfassung in Deutsch

In der vorliegenden Arbeit wurden die Wechselwirkungen von Gallensalzen an Liposomenmembranen näher untersucht. Liposomen dienen dabei aufgrund ihrer Ähnlichkeit zu Biomembranen als einfache Modellsysteme, um Interaktionen mit diesen näher zu beschreiben. Der Hauptteil der Arbeit beschäftigt sich mit der Erstellung von Bindungsdiagrammen verschiedener Gallensalze und der Ermittlung von lipidnormierten Verteilungskoeffizienten an die Mischmembran. Der an die Membran gebundene und freie Anteil des Gallensalzes wurde über ein indirektes Messverfahren bestimmt. Im Gegensatz zu direkten Messverfahren müssen beide Fraktionen nicht zunächst voneinander getrennt werden und zudem benötigt man kein spezifisches Analyseverfahren zu deren Quantifizierung.
Die Fluoreszenzsonde Laurdan, deren Fluoreszenzverhalten stark abhängig von der Umgebungspolarität ist, wurde dazu in die Liposomenmembran inkorporiert. Das Emissionsspektrum Laurdan-markierter Liposomen ist charakterisiert durch eine Schulter und ein charakteristisches Maximum. Die Veränderungen im Emissionsspektrum an diesen beiden Stellen, die nach Zugabe des Gallensalzes auftreten, wurden genutzt, um den freien und gebundenen Anteil zu ermitteln und um die Kinetik der Gallensalz-Bindung zu messen.
Es konnten Bindungsdiagramme verschiedener Gallensalze, die sich in ihrer Polarität und ihrem pKs-Wert unterscheiden, bei pH 7,4 aufgenommen werden und Verteilungskoeffizienten an die Mischmembran bestimmt werden. Die dabei gewählten Konzentrationsobergrenzen der Gallensalze wurden dabei bis kurz vor die Membransolubilisierung, die mittels Streulicht-Solubilisierungsversuche bestimmt wurde, gesetzt. Bei der Betrachtung des pH-Wert Einflusses im Bereich von pH 6,8 8,2 und damit des Ionisationsgrades des Gallensalzes auf die Membranverteilung, konnte für das Glycin-konjugierte Gallensalz Na-GCDC (pKs = 3,9 +/- 0,1) kein Einfluss gezeigt werden. In den Bindungsdiagrammen des unkonjugierten Gallensalzes Na-CDC (pKs = 5,0 +/- 0,1) machen sich hingegen Unterschiede bei den verschiedenen pH-Werten bemerkbar. Bei der Laurdan-Methode scheinen im Gegensatz zu der direkten Methode bei den Gallensalzen zusätzlich zu dem Bindungsvermögen der Bindungsmodus (Bindungstiefe) eine Rolle zu spielen. Die logD-Werte an die Mischmembran bei pH 7,4 liegen für beide Methoden in einer vergleichbaren Größenordnung.
Mit dieser etablierten Methode sollen in Zukunft Verteilungskoeffizienten von Arzneistoffen, die eine Membranwechselwirkung aufweisen, bestimmt werden.


Kurzfassung in Englisch

This thesis deals with the interaction of bile salts with liposomal membranes. Liposomes can act as a simple model system because of their similarity to biomembranes to examine the interaction with them. The main part of the work is about the generation of binding plots of different bile salts and the determination of lipid-standardised partition coefficients to bile salt containing (mixed) membranes. The membrane-bound and free fractions of the bile salts are quantified via an indirect method. In contrast to direct methods these fractions have not to be separated and furthermore, there is no need for a specific drug detection method.
The fluorescent dye Laurdan, which shows a fluorescent behaviour being strongly affected by its environment, was incorporated in the liposomal membrane. The emission spectrum of Laurdan-labelled liposomes is characterised by a shoulder at 434 nm and a maximum at 487 nm. The changes in the emission spectrum at these two wavelengths, which occur after addition of bile salts, were used to determine the free and membrane-bound parts as well as to measure binding kinetics of the bile salt.
Binding diagrams of different bile salts, which differ in their polarity and their pKa-value, were recorded at pH 7.4 and the partition coefficients to the mixed membrane could be determined. The upper limit concentrations of bile salts were below the onset of membrane solubilisation, which was detected via light scattering experiments. No effect of the pH value between pH 6.8 and 8.2 on the membrane distribution could be observed for the glycin-conjugated bile salt Na-GCDC (pKs = 3.9 +/- 0.1). In contrast, there are differences in the binding diagrams for the unconjugated form Na-CDC (pKs = 5.0 +/- 0.1) in the pH range examined. Contrary to the direct method the binding mode (binding depth) has an impact on the Laurdan fluorescent behaviour additionally to the binding capacity. The logD values to the mixed membrane at pH 7.4 are in good agreement for both methods.
This method is intended to be used in the future to determine the partition coefficients of drugs showing a membrane interaction.


SWD-Schlagwörter: Liposom , Fluoreszenzsonde , Gallensalze , Lipidmembran , Verteilungskoeffizient
Freie Schlagwörter (deutsch): Laurdan , Membranmodell , Bindungsstudie
Freie Schlagwörter (englisch): liposome , laurdan , partition coefficient , bile salt , fluorescence
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Schubert, Rolf (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 06.07.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 17.07.2009
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