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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-67842
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6784/


Weiß, Thomas

Analyses of histone modifications - H1.2K187 methylation and H3K64 methylation

Analysen von Histonmodifikationen - H1.2K187 Methylierung und H3K64 Methylierung

Dokument1.pdf (24.509 KB) (md5sum: d0272ea20e878ae194537ea5e4ea39f8)

Kurzfassung in Englisch

Histones get posttranslationally modified to a great extend, including methylation and ubiquitination. Many modifications of the unstructured tails of the core histones have been shown to be involved in the regulation of DNA-based processes such as DNA repair and transcription. However, comparably little is known about modifications in the globular domains of the core histones and on the linker histone H1. Yet, histone modifications can depend on one another and mediate their function in concert with other histone modifications. Only the knowledge of the entirety of histone modifications will therefore enable us to elucidate their interplay and to fully perceive their functioning mechanisms. Thus, the aim of this thesis was to identify and to study new histone methylation sites on H1 and in the core domain of H3.

Prior to this thesis, H1.4K26 was the only known methylation site on H1 and EZH2 was reported to methylate this residue. In this thesis, H1.2K187 was identified as a new methylation site methylated by G9a/Glp1 using a candidate approach. In order to map the site, a cluster mutation approach was developed, providing a new method for (histone) modification analysis, and used in combination with protease digestion. The site was confirmed by in vitro methylation assays on peptides as substrates. Moreover, a histone variant-specific methylation was demonstrated for the first time, by showing that G9a/Glp1 methylate H1.2K187 and H1.4K26 but not the corresponding lysines on H1.4 and H1.2, respectively. This adds further evidence to the hypothesis of specific functions for H1 variants. H1.2K187 was also shown to be methylated in vivo in collaboration with Benjamin Garcia (Princeton University) using mass spectrometric analysis of endogenous H1 from HEK293 cells. To further analyse H1.2K187 methylation in vivo, two siRNAs with high knockdown potential against G9a and Glp1 have been identified.

H3K64 methylation was identified by mass spectrometry, yet the function of this modification remained unknown. To address this question, an H3K64me3 antibody was characterized and shown to be highly specific for this modification. Prominent H3K64me3 foci were shown to form in a cell cycle dependent manner in T24 cells, whereas the overall amount of this modification does not change during the cell cycle. The transcription factors TBP and Oct1 as well as S2 phosphorylated RNA Pol II co-localize with these foci. Additionally, gammaH2AX, Ku80, PARP-1 and p53BP1, all involved in DNA repair, also co-localize with these H3K64me3 foci. Inhibition of histone ubiquitination strongly reduced foci formation, supporting the evidence for involvement of these foci in DNA repair.
Suv39h deficiency leads to loss of H3K64me3 in pericentric heterochromatin in mouse cells, which prompted us to investigate the role of the Suv39h pathway in H3K64me3 in more detail. However, Suv39h cannot methylate H3K64 in in vitro methylation assays. H3K64me3 is also independent of H3K9me3 on the same nucleosome. Additionally, the candidate HKMTs, Suv4-20h, G9a and Dot1, do not methylate H3K64 either. The functionally different H3 variants showed different levels of H3K64me3 with H3.2 and H3.3 being enriched in this modification compared with H3.1. This is in line with a role of H3K64me3 in DNA repair.

These studies led to the identification of a new methylation site on histone H1, the first demonstration of histone variant-specific methylation and the first functional analysis of H3K64me3, providing insights into the establishment of this mark and interesting links of this modification with DNA repair.


Kurzfassung in Deutsch

Histone werden in großem Ausmaß posttranslational modifiziert, z. B. methyliert und ubiquitiniert. Viele Modifikationen der unstrukturierten N-terminalen Arme der Histone sind in die Regulation von DNA-basierten Prozessen wie DNA Reparatur und Transkription involviert. Vergleichsweise wenig ist allerdings über Modifikationen in den globulären Domänen der Kernhistone und auf dem Verknüpfungshistone H1 bekannt. Histonmodifikationen können jedoch voneinander abhängig sein und entfalten ihre Wirkung in Zusammenarbeit mit anderen Histonmodifikationen. Nur die Kenntnis der Gesamtheit an Histonmodifikationen wird uns daher in die Lage versetzen, deren Vernetzungen und Funktionsmechanismen vollständig aufzuklären. Das Ziel dieser Arbeit war daher neue Methylierungsstellen auf H1 und in der Kerndomäne von H3 zu identifizieren und zu analysieren.

Vor dieser Doktorarbeit war H1.4K26 die einzige bekannte Methylierungsstelle auf H1 und EZH2 als dessen Histonlysinmethyltransferase (HKMT) charakterisiert worden. In dieser Doktorarbeit wurde H1.2K187 als neue Methylierungsstelle gezeigt und G9a und Glp1 wurden mit Hilfe eines Kandidatenversuchs als deren HKMTn identifiziert. Ein Clustermutationsversuch wurde entwickelt und in Kombination mit Proteaseverdau genutzt um die Methylierungsstelle zu bestimmen. Der Clustermutationsversuch stellt darüber hinaus eine neue Methode zur Analyse von (Histon-) Modifikationen dar. Die Stelle wurde durch in vitro Methylierungsversuchen auf Peptiden bestätigt. Zusätzlich konnte zum ersten Mal eine variantenspezifische Histonmethylierung gezeigt werden: G9a/Glp1 methylieren H1.2K187 und H1.4K26 aber nicht die entsprechenden Lysine auf H1.4 und H1.2. Dies liefert neue Hinweise auf variantenspezifische Funktionen von H1. Mit Hilfe einer massenspektrometrischen Analyse von endogenem H1 aus HEK293 Zellen konnte - in Kollaboration mit Benjamin Garcia (Princeton University) - gezeigt werden, dass H1.2 auch in vivo methyliert wird. Um die in vivo Methylierung von H1.2K187 weiter untersuchen zu können wurden zwei siRNAs mit hohem Reduktionspotential identifiziert.

Die Methylierung von H3K64 wurde durch massensprektrometrische Analysen entdeckt, die Funktion dieser Modifikation blieb jedoch unbekannt. Um diese Frage anzugehen wurde ein spezifischer Antikörper gegen die Modifikation H3K64me3 charakterisiert. Obwohl die Gesamtmenge an H3K64me3 während des Zellzyklus unverändert bleibt bilden sich zellzyklusabhängig hervorstechende H3K64me3 Ansammlungen. Die Transkriptionsfaktoren TBP und Oct1 ebenso wie S2 phosphorylierte RNA Pol II colokalisieren mit diesen Ansammlungen. Zusätzlich colokalisieren auch gammaH2AX, Ku80, PARP-1 und p53BP1; alle diese Proteine sind in die DNA Reparatur involviert.
Suv39h Defizienz führt zu einem Verlust von H3K63me3 in perizentrischem Heterochromatin in Mauszellen. Dies veranlasste uns dazu die Rolle des Suv39h Weges bezüglich H3K64me3 näher zu untersuchen. Suv39h methyliert jedoch nicht H3K64, wie in in vitro Methylierungsversuchen gezeigt werden konnte. H3K64me3 ist ebenfalls unabhängig von H3K9me3 innerhalb desselben Nukleosoms. Auch die Kandidaten-HKMT Suv4-20h, G9a und Dot1 methylieren H3K64 nicht. Die funktionell verschiedenen H3 Varianten zeigten unterschiedliche Niveaus an H3K64me3, wobei H3.2 und H3.3 gegenüber H3.1 erhöhte Niveaus an H3K64me3 besitzen. Dies würde mit einer Rolle von H3K64me3 in der DNA Reparatur einhergehen.

Diese Doktorarbeit führte zur Identifikation einer neuen Methylierungsstelle auf H1, zur ersten Demonstration einer variantenspezifischen Methylierung sowie zur ersten funktionalen Analyse von H3K64me3 und lieferte damit Einblicke in die Etablierung dieser Modifikation und interessante Verbindungen zu DNA Reparatur.


SWD-Schlagwörter: Methylierung , Epigenetik , Histon-Methyltransferase , Posttranslationale Änderung
Freie Schlagwörter (deutsch): Histonmodifikationen
Freie Schlagwörter (englisch): Histone Modification , Epigenetic , Methylation , Histone Methyltransferase
Institut: Max-Planck-Institut für Immunbiologie
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Baumeister, Ralf (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 08.07.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 28.07.2009
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