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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-67911
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6791/


Loivamäki, Maaria

Molecular biological and (eco)physiological studies on isoprene emission in Arabidopsis and Grey poplar

Molekularbiologische und (öko)physiologische Untersuchungen zur Isoprenemission bei Arabidopis und Graupappel

Dokument1.pdf (1.299 KB) (md5sum: 7e2c05abec26d0afd67ec260d0a44946)

Kurzfassung in Englisch

Plants interact with their environment with a great variety of volatile organic compounds (VOCs), isoprenoids (≡ terpenes), i.e. isoprene, mono-, homo-, di- and sesquiterpenes, being the most prominent group. Isoprene, a hemiterpene, is the simplest isoprenoid compound whose main source, woody plant species, comprises 75% of the 500 Tg C isoprene emitted to the atmosphere per year. Due to the significant influence of isoprene in atmospheric chemistry, growing research interests have focused to investigate this C5 compound. However, physiological function(s) of isoprene emission in planta is not elucidated to date. Actual studies indicate that isoprene can enhance thermotolerance or quench oxidative stress, but the underlying mechanisms are widely unknown. The work presented here significantly contributes to the understanding of physiological function of isoprene and regulation of isoprene biosynthesis by exploiting transgenic Arabidopsis thaliana and Populus x canescens as model systems.

The first part of the work aimed to elucidate whether isoprene biosynthesis in plants is triggered by endogenous regulatory mechanisms like the circadian clock. Isoprene emission varies diurnally in several species, also in the natural isoprene emitter Grey poplar (P. x canescens). Moreover it was recently proved that the poplar isoprene synthase gene (PcISPS) displays diurnal variation in its expression. Working on shoot cultures of Grey poplar, placed under different light regime in climate chambers, it was possible to show that under continuous light PcISPS expression, measured by quantitative reverse transcriptase PCR, oscillated with amplitude of approximately 24 hours testifying for endogenous clock regulation. Furthermore, circadian rhythms were not only limited to the level of gene expression. Isoprene emission rates also displayed circadian changes. In contrast, on the protein level circadian changes could not be detected. It, however, appeared that PcISPS activity and protein content became reduced under constant darkness, while under constant light activity and protein content were higher than under day/night regime. Measurement of additional selected isoprenoid genes revealed that phytoene synthase (PcPSY; carotenoids pathway) also displays circadian fluctuations of gene expression whereas 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (PcDXR), the first committed enzyme of the methylerythritol phosphate (MEP)-pathway only shows a light regulation of its expression.

In the second part of the work Arabidopsis thaliana (ecotype Columbia-0), a natural non-emitter of isoprene, has been constitutively transformed with PcISPS from Grey poplar. Over-expression of poplar ISPS in Arabidopsis resulted in isoprene emitting rosettes that showed enhanced growth rates compared to wild type under moderate thermal stress. The fact that highest growth rates, higher DMADP levels and ISPS enzyme activities were detected in young developing plants indicates that enhanced growth of the transgenic plants under thermal stress is due to the introduced PcISPS gene. However, the emission rates did not reach the level of natural isoprene emitters, like poplars, suggesting possible different regulation of the isoprene biosynthesis and/or lack of substrate for that. To study the physiology of these plants a dynamic gas exchange system was developed allowing miming the natural rapid fluctuations of leaf temperature and light intensity (‘sun- or lightflecks’) in order to study isoprene emission. The results showed that wild type Arabidopsis is already well enough thermotolerant against transient and moderate light and/or heat stress. In contrast, when the same conditions, combining light and heat flecks, were applied to wild type and transgenic Grey poplar lines in which gene-expression of PcISPS was knock-down by RNA interference technology, assimilation was impaired in the non-isoprene emitting lines compared to wild type. Thus, for poplar the ability to emit isoprene can be detrimental.

Transgenic Arabidopsis lines were further applied in ecophysiological studies to investigate the role of isoprene in plant-insect interactions. Feeding of herbivores on plants makes plants release volatile compounds that attract herbivore enemies. In all the performed studies the parasitic wasp Diadegma semiclausum searching for its host Plutella xylostella (Diamondback moth) preferred the volatiles emitted by wild type Arabidopsis to those from transgenic, isoprene emitting Arabidopsis plants. Furthermore low external isoprene concentration in the volatile blend of either Arabidopsis or herbivore-infested Brassica oleracea, the natural host of the Diamondback moth, repelled the parasitic wasps. The behaviors of the two examined herbivores (Pl. xylostella and Pieris rapae (Small White Cabbage butterfly)) were not affected by isoprene emission, and GC-MS detection showed despite of isoprene no other differences in the VOC blends of wild type and transgenic plants. These findings suggest that isoprene emission of plants plays a complex ecophysiological role, influencing biotic interactions between plants and insects.


Kurzfassung in Deutsch

Pflanzen stehen mit ihrer Umgebung in ständiger Wechselwirkung durch die Abgabe verschiedener flüchtiger organischer Verbindungen. Die größte Stoffklasse dieser Verbindungen stellen die Terpene dar; zu ihnen gehören u. a. Isopren, Mono-, Sesqui-, Homo- und Diterpene. Isopren, ein Hemiterpen, ist das am einfachsten gebaute Terpen und wird vor allem von holzigen Pflanzen emittiert. Aufgrund seines bedeutenden Einflusses auf die Chemie der Atmosphäre steht Isopren verstärkt im Fokus der Forschung. Trotz dieser Bedeutung ist die physiologische Funktion der Isoprenemission in Pflanzen größtenteils ungeklärt. Aktuelle Studien weisen darauf hin, dass die Produktion von Isopren die Resistenz der Pflanzen sowohl gegenüber thermalem als auch oxidativem Stress erhöhen kann. Die vorliegende Arbeit liefert einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der physiologischen Funktion von Isopren und der Regulierung der Isoprenbiosynthese. Als Modellpflanzen für die Untersuchungen wurden transgene Arabidopsis thaliana und Populus x canescens herangezogen, in denen die Isoprenbiosynthese verändert war.

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit die Isoprenbiosynthese von Pflanzen durch endogene Regulationsmechanismen wie die „Innere Uhr“ gesteuert wird. Gewöhnlich weist die Isoprenemission einen ausgeprägten, vom Licht abhängigen, Tageslauf auf. Diese Diurnalität ließ sich auch auf der molekularen Ebene für die Genexpression der Isoprensynthase (PcISPS) nachweisen. Durch kontrollierte Klimakammerversuche mit verschiedenen Lichtregimes konnte an Sprosskulturen der Pappel nachgewiesen werden, dass dieser charakteristische Tagesverlauf nicht nur durch Licht, sondern auch endogen durch circadiane Faktoren gesteuert wird. Quantitative Messungen der Transkriptmengen unter Dauerlicht zeigten, dass die Genexpression der PcISPS mit einer Amplitude von ca. 24 Stunden oszilliert. Diese endogene Rhythmik konnte auch für die Isoprenemission selbst nachgewiesen werden. Der Proteingehalt und die Enzymaktivität der ISPS wurden hingegen durch die „Innere Uhr“ nicht beeinflusst. Allerdings wurden bei anhaltender Helligkeit ein höherer Proteingehalt und eine stärkere Enzymaktivität festgestellt als bei dauerhafter Dunkelheit. Die Messung weiterer Gene des Isoprenoidstoffwechsels zeigte, dass auch die Phytoensynthase (PcPSY; Gen aus dem Carotinoid-Stoffwechsel) circadian reguliert wird, während die 1-Deoxy-D-xylulose 5-reduktoisomerase (PcDXR), das Eingangsenzym des Methylerythritol-Stoffwechsels, lediglich einer Lichtregulation unterliegt.

Im zweiten Teil der Arbeit wurde Arabidopsis thaliana, (Ökotyp Columbia-0), eine natürlicherweise nicht Isopren emittierende Pflanze, mit dem Gen der Isoprensynthase (ISPS) aus der Pappel transformiert. Die Expression der PcISPS in Arabidopsis führte zu einer Emission von Isopren, die jedoch verglichen zu der Emission aus Pappeln viel geringer war. Wachstumsanalysen zeigten, dass die transformierten Isopren emittierenden Pflanzen unter moderatem Temperaturstress ein besseres Wachstum als der nicht emittierende Wildtyp aufwiesen. Die Beobachtung, dass die stärksten Wachstumsunterschiede, die höchsten Konzentrationen an Dimethylallyldiphosphat (DMADP), dem Substrat der ISPS, und die höchsten Enzymaktivitäten in jungen, sich entwickelnden Blättern auftraten, deutet auf einen funktionellen Zusammenhang zwischen dem Einbringen des PcISPS-Gens und der physiologischen Reaktion hin. Für die physiologischen Studien an diesen Pflanzen musste ein neues dynamisches Gasaustauschsystem entwickelt werden, das Photosynthese- und Emissionsmessungen an Arabidopsis-Rosetten und Pappelblättern bei schnellem Wechsel von Lichtintensitäten und Blatttemperaturen ermöglicht. Es zeigte sich, dass Arabidopsis-Blätter generell eine hohe Thermotoleranz aufweisen. Dagegen wiesen transgene, nicht Isopren emittierende Pappellinien, bei denen die Genexpression der ISPS über RNA-Interferenz (RNAi) unterdrückt wurde, unter identischen Bedingungen eine starke Beeinträchtigung der Photosyntheseleistung und des photosynthetischen Elektronentransports bei kurzfristigem Licht- und Temperaturstress im Vergleich zu entsprechenden Wildtypen auf. Die Ergebnisse liefern einen klaren Beweis dafür, dass die Fähigkeit Isopren zu emittieren eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung von photosynthetischen Prozessen in der Pappel einnimmt.

Transgene Linien von Arabidopsis wurden des Weiteren für ökophysiologische Studien herangezogen, um die Rolle von Isopren bei Pflanzen-Insekten-Interaktionen zu untersuchen. Fressen herbivore Insekten an Pflanzen, löst dies eine Abwehrreaktion aus, die zur Abgabe von flüchtigen organischen Verbindungen führen kann, die als Lockstoffe für Feinde der Herbivoren fungieren. In den durchgeführten Studien konnte bewiesen werden, dass die parasitische Schlupfwespe Diadegma semiclausum auf der Suche nach ihrem Wirt Plutella xylostella (Kohlmotte) jeweils den Wildtyp gegenüber den Isopren emittierenden Pflanzen beworzugte. Wurden der Schlupfwespe zwei befallene Kohlpflanzen (Brassica oleracea), der natürliche Wirt der Kohlmotte, oder Wildtyp Arabidopsis-Pflanzen angeboten, eine jedoch mit Isopren begast, bevorzugte die Schlupfwespe auch hier die Isopren-freien Varianten. Das Verhalten der beiden untersuchten Herbivoren (Pl. xylostella und Pieris rapae (Kleiner Kohlweissling)) wurde dagegen nicht durch Isopren beeinflusst. Diese Erkenntnisse weisen darauf hin, dass die Isopren Emission eine komplexe Rolle bei biotischen Interaktionen zwischen Pflanzen und Insekten spielt.


SWD-Schlagwörter: Isopren , Ackerschmalwand , Pappel
Freie Schlagwörter (deutsch): flüchtiger organischer Verbindungen , thermotoleranz , Pflanzen-Insekten-Interaktionen
Freie Schlagwörter (englisch): isoprene , volatile organic compounds , thermotolerance , plant-insect interactions , circadian rhythm
Institut: Institut für Forstbotanik und Baumphysiologie
Fakultät: Fakultät für Forst- und Umweltwissenschaften
DDC-Sachgruppe: Land- und Forstwirtschaft, Veterinärmedizin
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Jörg-Peter Schnitzler (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.07.2008
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 28.07.2009
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