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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-68159
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6815/


Daum, Martina

Modifizierende enzymatische Reaktionen in der Biosynthese der antibiotisch aktiven Naturstoffe Phenalinolacton und Polyketomycin

Tailoring enzymes in the biosynthesis of the antibiotically active natural products phenalinolactone and polyketomycin

Dokument1.pdf (11.787 KB) (md5sum: ca72c08818f29a0e652f76c135a38f26)

Kurzfassung in Deutsch

Modifizierende Enzyme haben im Sekundärstoffmetabolismus einen entscheidenden Einfluss auf die strukturelle und funktionelle Diversität des gebildeten Naturstoffs. Zahlreiche Beispiele sind bekannt, bei denen eine kleine Änderung der Struktur zu einer großen Änderung der Bioaktivität des Naturstoffs führte. Die diterpenoiden Phenalinolactone und das Polyketid Polyketomycin sind antibiotisch aktive Sekundärmetabolite, die von Arten der Gattung Streptomyces gebildet werden. In deren Biosynthese wird das terpenoide beziehungsweise polyketidische Grundgerüst durch zahlreiche modifizierende Enzyme zur antibiotisch aktiven Substanz umgewandelt.

1. Die Phenalinolactone enthalten einen stark oxidierten gamma-Butyrolactonring, dessen Biosynthese aufgeklärt wurde.
• Dazu wurde ein in vitro Assay mit der zuvor heterolog exprimierten Eisen(II)/alpha-ketoglutaratabhängigen Dioxygenase PlaO1 etabliert. Es wurde gezeigt, dass dieses einzigartige Enzym die mehrstufige Umwandlung, bestehend aus oxidativer Umlagerung und Zyklisierung, der linearen beta, gamma-ungesättigten alpha-Ketosäure der Phenalinolacton-Vorstufe PL-CD6 zum gamma-Butyrolactonring katalysieren kann.
• Katalytisch essenzielle Aminosäuren in PlaO1 wurden durch Punktmutationsexperimente identifiziert.
• Es wurde ein Expressions- und Aufreinigungsverfahren im Großmaßstab etabliert, um PlaO1 für dessen Kristallisation zu gewinnen.
• Die drei nicht-terpenoiden Kohlenstoffe des gamma-Butyrolactonrings stammen aus dem Glukosemetabolismus, was mittels eines Fütterungsexperiments mit D-[U-13C]-Glukose gezeigt wurde.

2. Durch Inaktivierung von plaV im Phenalinolacton-Biosynthesegencluster und Strukturaufklärung der akkumulierenden Desacetyl-Phenalinolactone konnte PlaV, dessen Primärsequenz ungewöhnlicherweise Ähnlichkeiten zu beta-Lactamasen und Esterasen zeigt, die Funktion der 3-O-Acetyltransferase in der Phenalinolacton-Biosynthese zugeordnet werden.

3. Die Inaktivierung des Dehydrogenasegens plaU im Phenalinolacton-Biosynthesegencluster inhibierte nicht die Produktion der Hauptmetabolite PL-A und PL-D.

4. Polyketomycinon und 6-Methylsalicylsäure sind polyketidische Strukturelemente des antibiotisch aktiven Polyketomycins und liegen methyliert vor.
• Die Funktion der drei S-Adenosyl-L-Methionin-abhängigen Methyltransferasen PokMT1, PokMT2 und PokMT3 konnte durch Geninaktivierung den einzelnen Methylguppen des Polyketomycins zugeordnet werden.
• Die Akkumulation und Strukturaufklärung neuer Polyketomycin-Derivate brachte wichtige Erkenntnisse bezüglich des Zeitpunkts der Methylierungs¬reak¬tionen während der Biosynthese und erzeugte ein Desmethyl-Polyketomycin mit veränderter antibiotischer Aktivität.
• PokMT1 wurde rekombinant in löslicher Form gewonnen. Es zeigte sich in einem in vitro Assay, dass diese Methyltransferase nicht die angebotenen aromatischen Substrate methyliert.


Kurzfassung in Englisch

Modifying enzymes play a crucial role during the biosynthesis of secondary metabolites. They often influence the structural and functional diversity of these natural products. Only little structural changes in these metabolites can cause an enormous difference in their bioactivity. The diterpenoid phenalinolactones and the polyketide polyketomycin are both antibiotically active and produced by members of the family of Streptomycetaceae. During their biosynthesis the assembled scaffold is converted to the antibiotically active compound by numerous tailoring enzymes.


1. The phenalinolactones comprise a highly oxidized gamma-butyrolactone moiety with an elusive biosynthetic origin. The Fe(II)/alpha-ketoglutarate dependent dioxygenase PlaO1, which corresponding gene was heterologously expressed, enabled the in vitro conversion of its assigned substrate PL-CD6. This unique enzyme catalyzes the rearrangement of the linear beta, gamma-unsaturated alpha-keto acid of that phenalinolactone precursor to the gamma-butyrolactone. By means of site directed mutagenesis several catalytically active amino acids were identified in PlaO1. Furthermore stable isotope feeding experiments with biosynthetic precursors shed light on the origin of the carbons in the gamma-butyrolactone moiety.

2. The inactivation of the gene plaV of the biosynthetic gene cluster of the phenalinolactones led to the accumulation of deacetyl-phenalinolactones. The function of PlaV could be assigned to the 3-O-acetyltransferase although its amino acid sequence does not resemble such enzymes.

3. The inactivation of the dehydrogenase gene plaU, which is also located in the phenalinolactone-cluster, did not block the production of the main metabolites PL-A and PL-D.

4. The decaketide-derived polyketomycinone und the tetraketide-derived 3,6-dimethylsalicylic acid are structural elements of the antibiotic polyketomycin that both carry methyl groups which were derived from S-adenosylmethionine. In order to obtain valuable information about these tailoring steps, gene inactivation experiments were performed. The generation of mutants with deletions in the methyltransferase genes pokMT1, pokMT2 and pokMT3 resulted in new polyketomycin derivatives, providing information about the organization of the biosynthetic pathway.


SWD-Schlagwörter: Streptomyces diastatochromogenes , Antibiotikum , Naturstoff , Methyltransferase <S>
Freie Schlagwörter (deutsch): Phenalinolacton , Polyketomycin , alpha-ketoglutarat-abhängige Dioxygenase , Streptomyces sp. Tü6071
Freie Schlagwörter (englisch): streptomyces , natural product , methyltransferase , 2-oxoglutarate dependent dioxygenase
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Bechthold, Andreas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 03.07.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 18.08.2009
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