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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-68658
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6865/


Mahalingam, Mohana

Insights into the activation and the deactivation mechanism of g-protein coupled receptor-rhodopsin : a study by FTIR spectroscopy

Untersuchung des Aktivierungs- und Deaktivierungsmechanismus des G-Protein gekoppelten Rezeptors Rhodopsin : eine FTIR-Spektroskopische Studie

Dokument1.pdf (4.257 KB) (md5sum: a1d7d8de639b9f9f246eedff633cf6d8)

Kurzfassung in Deutsch

Untersuchungen zum Deaktivierungsmechanismus: Der Photorezeptor Rhodopsin wird als Prototyp für die Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren betrachtet. Rhodopsin setzt sich in Wirbeltieren aus dem Apoprotein Opsin und dem Chromophor 11-cis-Retinal zusammen, welches über eine protonierte Schiff-Base (PSB) kovalent an das Protein gebunden ist. Starke Helix-Verschiebungen, die durch die Photoisomerisierung des Chromophors zu all-trans-Retinal ausgelöst werden, führen letztendlich zur Ausbildung des aktivierten Rezeptor-Zustands Meta II. Der darauf folgende Zerfall des Meta II-Zustands stellt seinerseits einen wichtigen Schritt dar, um die Funktionsfähigkeit der Photorezeptor-Zelle aufrecht zu erhalten. Dieser Zerfall kann auf zwei verschiedene Weisen erfolgen: Entweder wird der aktivierende Ligand all-trans-Retinal aus der Bindungstasche freigesetzt, wodurch das Apoprotein Opsin entsteht oder es kommt durch thermische Isomerisierung einer Doppelbindung des gebundenen Liganden zur Ausbildung einer weniger aktivierenden Spezies und somit zum Übergang nach Meta III. Letzteres wird in vitro bei neutralem bis alkalischem pH bevorzugt gebildet. Meta III entsteht durch thermische Isomerisierung der Schiff-Basenbindung des Retinals (C15=N). Hierbei wird der gebundene Ligand von all-trans 15-anti in das all-trans 15-syn-Isomer umgewandelt. Dadurch ergibt sich eine Änderung in der Liganden-Geometrie, die wiederum eine inaktive Konformation des Rezeptors bewirkt. In dieser Arbeit wurde die Meta III-Konformation über einen größeren pH-Bereich untersucht. Dabei wurde aufgeklärt, dass Meta III in einem pH-abhängigen Gleichgewicht existiert. Dieses Gleichgewicht stellt sich zwischen der inaktiven Konformation bei neutralem bis alkalischem pH und einer aktiven, dem Meta II-Zustand ähnlichen Konformation bei eher saurem pH ein. Der scheinbare pKa-Wert dieses Übergangs liegt bei etwa 5,1. Dies stellt einen um einige Einheiten niedrigeren pKa-Wert dar als der Wert, der für das Meta I/Meta II-Gleichgewicht, in welchem ein 15-anti-Ligand vorliegt, bestimmt wurde. Dennoch ist er um etwa eine Einheit höher als der pKa-Wert für das Konformationsgleichgewicht des Opsins, d. h. wenn überhaupt kein Ligand anwesend ist. Beim all-trans-15-syn-Chromophor handelt es sich also um keinen inversen Agonisten, der wie 11-cis oder 9-cis-Retinal eine inaktive Konformation des Rezeptors erzwingt, sondern um einen klassischen partiellen Agonisten.
Untersuchungen zum Aktivierungsmechanismus: Bei der Rhodopsin-Aktivierung kommt es zum Aufbrechen einer konservierten interhelikalen Wechselwirkung auf der cytoplasmatischen Seite, die zwischen dem ERY-Motiv auf der transmembranären Helix 3 und einigen Seitenketten auf Helix 6 besteht. In dieser Arbeit haben wir durch Mutagenese von Glu134 und Arg135 auf H3 sowie Glu247 und Glu249 auf H6 untersucht, welche Rolle diese Seitenketten dabei spielen. Hierfür wurden die Pigmente in Lipidmembranen rekonstituiert. Durch die pH-Abhängigkeit der Rhodopsin-Aktivierung wird deutlich, dass während der Aktivierung die Aufnahme eines Protons erfolgt. Aus dem Protonierungsmuster im FTIR-Spektrum konnte geschlossen werden, dass Glu134 dabei als Protonen-Akzeptor dient. Nach Mutation von Glu134 durch Ersatz von Glutamat (E) mit der neutralen Aminosäure Glutamin (Q) war keine pH-Abhängigkeit der Rezeptor-Aktivierung mehr vorhanden. Ersatz von Arg 135 (R135) mit neutralem Leucin (L) führte ebenfalls zu einer vollkommen pH-unabhängigen Rezeptor-Aktivierung. Anders als E134Q wiesen die Meta II-Spektren von R135L einige erhebliche Unterschiede zu den entsprechenden Wildtyp-Spektren auf, was auf strukturelle Unterschiede hindeutet. Die Neutralisierung von E247 und E249 auf H6, die an den interhelikalen Wechselwirkungen mit H3 bzw. H7 beteiligt sind, führt zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zu Meta II, wobei die pH-Abhängigkeit allerdings erhalten bleibt. Der pKa-Wert wird dabei um etwa 1,5 Einheiten angehoben. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Neutralisierung von Glu134 und Arg135 um einiges entscheidender für die Verschiebung des Gleichgewichts der Photoprodukte ist als das Aufbrechen der interhelikalen Wechselwirkungen von Glu247 und Glu249 auf H6 mit H3 und H7. Dies zeigt, dass die interhelikale Salzbrücke zwischen H3 und H7 viel weniger ausschlaggebend ist als die intrahelikale Wechselwirkung auf dem ERY-Motiv.Im Konformationsübergang zum aktiven Meta II-Zustand werden durch die Licht-Aktivierung des Liganden Retinal zwei Protonierungen ausgelöst, die die Funktion eines zweistufigen Schaltmechanismus haben. Der erste Schalter beinhaltet das Aufbrechen einer interhelikalen Salzbrücke durch einen internen Protonenübergang von der protonierten Schiff-Base des Retinals hin zu ihrem Gegenion Glu113 in der transmembranären Domäne. Der zweite Schalter besteht aus einer Protonenaufnahme aus der Lösungsmittelumgebung durch Glu134 des konservierten ERY-Motivs am zytoplasmatischen Ende von H3. Dies führt dann zu der pH-abhängigen Rezeptor-Aktivierung wie oben beschrieben. Die Aktivierungsmechanismen von Rhodopsin wurden in dieser Arbeit mittels UV-Vis und FTIR-Spektroskopie untersucht und gezeigt, dass diese beiden Protonierungs-Schalter bei physiologischem pH teilweise voneinander abgekoppelt sind. Diese teilweise Abkopplung gestattet die Ausbildung des Entropie-stabilisierten Meta II-Zustands. Hier finden die Konformationsänderungen, die mit der Rezeptor-Aktivierung zusammenhängen, auch dann statt, wenn keine Protonierung von Glu 134 vorliegt.Das Aufbrechen der Salzbrücke zwischen der PSB und ihrem komplexen Gegenion ist also eine strukturelle Voraussetzung für die aktivierenden Helix-Bewegungen, während die Protonierung von Glu134 aus thermodynamischen Gründen erforderlich ist, um das konformative Gleichgewicht ganz auf die Seite der aktiven Meta II-Konformation zu verschieben. Obwohl die strukturelle Rolle des Aufbrechens der PSB-Salzbrücke in ähnlicher Weise für in Detergens gelöstes Rhodopsin beobachtet wird,ist die thermodynamische Funktion des zweiten Schalters wegen der abgesenkten Enthalpie-Änderung beim Übergang nach Meta II in Detergens-Umgebung nicht notwendig. Somit ist sowohl in natürlichen als auch in synthetischen Membranen eine sequenzielle Destabilisierung der beiden Salzbrücken für die vollständige Rezeptoraktivierung erforderlich. Die ähnliche Struktur der intrahelikalen Salzbrücke in Strukturen des Adrenergen Rezeptors legen eine ähnliche thermodynamische Rolle dieses zweiten Schalters für die Aktivierung anderer Mitglieder aus der Familie Rhodopsin-ähnlicher Rezeptoren nahe.


Kurzfassung in Englisch

Rhodopsin a prototypical G protein coupled receptor is made up of opsin apoprotein and a chromophore, 11-cis retinal. Rhodopsin is activated by the light isomerization of its 11-cis-retinal chromophore, which is covalently bound in a chromophore binding pocket in the transmembrane core of the membrane protein via a protonated Schiff base to Lys296 on transmembrane helix 7. The isomerization from 11-cis to all-trans switches this chromophoric ligand from an inverse agonist, which stabilizes the completely inactive conformation of the dark state, to a full agonist, driving the subsequent protein changes in the conformational transition to the active state, Meta II.
Study on the deactivation pathway: The active Meta II receptor decays by two fundamentally different pathways. One involves hydrolysis of the retinal schiff base in Meta II, leading to the release of all-trans-retinal from its binding pocket. The other pathways involves thermal isomerization of the C15=N double bond of the retinal schiff base from an extended 15-anti (trans) geometry to 15-syn (cis), leading to the formation of Meta III and consequently deactivation of the receptor. In this current study by FTIR spectroscopy it is shown that the Meta III decay rate is pH dependent. The apparent pKa of the active/inactive state equilibrium is downshifted to 5.1 from above 8 for the Meta I/Meta II equilibrium. But this is still above the pKa of the opsin which indicates that the all-trans-15-syn-retinal ligand of Meta III is not an inverse agonist, but a classical partial agonist.
Study of the activation pathway: In family A G-PCRs, the cytoplasmic network between the conserved E(D)RY motif on H3 and H6 is thought to form an ionic lock that is disrupted during the receptor activation, releasing constraints on relative movement of the two helices. Mutations on both sides of the network were shown to increase basal activity in many receptors. Glu134 of the ERY motif in rhodopsin forms an intrahelical salt bridge with Arg135 in dark state crystal structure of rhodopsin. Also there exist interhelical interactions of Glu247 and Glu249 on H6 with H3 and H7 respectively. In order to study the significance of these interactions and to answer which poses important constraint on the receptor for the activation, several site directed mutants of these residues of rhodopsin were investigated using FTIR spectroscopy in the current study. Activation of rhodopsin is pH-dependent with proton uptake during the transition from the inactive Meta I to the active Meta II state. Glu134 of the ERY motif is identified as the proton-accepting group, using the Fourier transform infrared protonation signature and the absence of a pH dependence of activation in the E134Q mutant. Neutralization of Arg135 similarly leads to pH-independent receptor activation, but with structural alterations in the Meta II state. Neutralization of Glu247 and Glu249 on H6, which are involved in interhelical interactions with H3 and H7, respectively, led to a shift toward Meta II in the E247Q and E249Q mutants while retaining the pH sensitivity of the equilibrium. Disruption of the interhelical interaction of Glu247 and Glu249 on H6 with H3 and H7 plays its role during receptor activation, but neutralization of the intrahelical salt bridge between Glu134 and Arg135 is considerably more critical for shifting the photoproduct equilibrium to the active conformation. These conclusions are discussed in the context of recent structural data of the ß2-adrenergic receptor.
Activation of rhodopsin, initiated by light-induced isomerization of the retinal ligand, triggers 2 protonation switches in the conformational transition to the active receptor state Meta II. The first switch involves disruption of an interhelical salt bridge by internal proton transfer from the retinal protonated Schiff base (PSB) to its counterion, Glu113, in the transmembrane domain. The second switch consists of uptake of a proton from the solvent by Glu134 of the conserved E(D)RY motif at the cytoplasmic terminus of helix 3, leading to pH-dependent receptor activation. In the current study by using a combination of UV–visible and FTIR spectroscopy, the activation mechanism of rhodopsin in different membrane environments was studied and showed that these 2 protonation switches become partially uncoupled at physiological temperature. This partial uncoupling leads to around 50% population of an entropy-stabilized Meta II state in which the interhelical PSB salt bridge is broken and activating helix movements have taken place but in which Glu134 remains unprotonated. This partial activation is converted to full activation only by coupling to the pH-dependent protonation of Glu134 from the solvent, which stabilizes the active receptor conformation by lowering its enthalpy. In a membrane environment, protonation of Glu134 is therefore a thermodynamic rather than a structural prerequisite for activating helix movements. In light of the conservation of the E(D)RY motif in rhodopsin-like G-PCRs, protonation of this carboxylate also may serve a similar function in signal transduction of other members of this receptor family.


SWD-Schlagwörter: Rhodopsin , FT-IR-Spektroskopie , Ortspezifische Mutagenese , Retinalproteine
Freie Schlagwörter (deutsch): FTIR-Spektroskopie, G-PCR
Freie Schlagwörter (englisch): Rhodopsin , FTIR spectroscopy , site-directed mutagenesis , G-PCR research
Institut: Institut für Physikalische Chemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Siebert, Friedrich (Prof.Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.10.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 02.11.2009
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