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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-68954
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6895/


Wößner, Sylvie

The influence of Igk genomic sequences on RS recombination and immunoglobulin light chain isotype expression

Der Einfluß genomischer Sequenzen des Igk Genlokus auf RS Rekombination und die Expression der Immunoglobulin leichten Ketten Isotypen

Dokument1.pdf (6.811 KB) (md5sum: 0fd2337821789493b11677627dba1bb6)

Kurzfassung in Deutsch

Der B-Zell-Antigen-Rezeptor enthält zwei identische schwere Ketten und zwei identische leichte Ketten. Bei der Maus und beim Menschen gibt es zwei verschiedene Isotypen von leichten Ketten, Igk und Igl. Das RS (recombining sequence) Element in der Maus und das entsprechende KDE (kappa deleting element) Element im Menschen sind Sequenzen, die sich am 3’ Ende des Igk Genlokus befinden und nach Aktivierung zu Sequenzen 5’ der Igk konstanten Region (Ck) rekombiniert werden können. Durch diese RS-Rekombination wird der Igk Genlokus inaktiviert. Igl exprimierende B-Zellen haben sehr oft ihre Igk Genloki durch eine RS-Rekombination inaktiviert. Verschiedene Hypothesen versuchen die biologische Funktion des RS Elements zu erläutern. RS-Rekombination, könnte entweder einen positives Signal für die Igl Genlokus Rekombination erzeugen oder ein möglichen Repressor eliminieren, der Igl Rekombination inhibiert. Zur Überprüfung der zuletzt genannten Hypothese wurden zwei verschiedene transgene Mäuse (RSA und RSF) generiert, die zusätzlich 17kb beziehungsweise 30kb Sequenzen des Maus-Igk Genlokus als Transgen erhalten haben. Das RSF Transgen umfasst das gesamte 3’ Ende des Igk Genlokus von Jk5 bis zum RS Element, wohingegen dem RSA Transgen 11kb Igk Genlokus-Sequenzen einschließlich des Ed Enhancers fehlen. Auf beiden Transgenen wurde die Rekombination Signal Sequenz (RSS) des RS Elements so mutiert, dass keine RS-Rekombination mehr stattfinden sollte. Folglich würde ein möglicher Repressor, der auf den zu eliminierenden Sequenzen lokalisiert ist, nicht entfernt werden. Der Hypothese zufolge wäre Rekombination des Igl Genlokus damit blockiert. Meine Untersuchungen zeigen jedoch, dass das Verhältnis von Igk zu Igl exprimierenden B-Zellen in den transgenen Tieren normal ist. Damit konnte in dieser Arbeit ein Repressor-Model nicht bestätigt werden kann.
Generell ist die B-Zell-Entwicklung durch die genannten Transgene leicht beeinträchtigt. Am auffälligsten ist eine Reduktion der peritonealen B1a-Zellen. Möglicherweise konkurrieren die RSA und RSF Transgene mit endogenen Igk Genloki um eine limitierte Menge an Transkriptionsfaktoren. Dabei scheint der mögliche Mangel an diesen Faktoren B1a-Zellen besonders schwer zu beeinträchtigen.
Es wurde beobachtet, dass das RSA Transgen, welchem 11kb der Igk Genlokus DNA-Sequenz einschließlich des Ed Enhancers fehlen, sehr aktiv in pro B-Zellen ist, wohingegen das RSF Transgen in diesen Zellen nicht transkribiert wird. Dies könnte darauf hindeuten, dass Igk-Sequenzen dieser Region den Genlokus inaktiv halten. Eine vergleichende Sequenzanalyse dieser Region zwischen verschiedenen Spezies weist in der Tat auf drei, bis jetzt noch nicht näher charakterisierte, konservierte Regionen hin.
Mit Hilfe der 3DFISH Technik wurde die Lokalisierung der transgenen und endogenen Igk Genloki während der B-Zell-Entwicklung untersucht. Es wurde beobachtet, dass transgene wie endogene Genloki im Zentrum von pre B-Zell-Kernen lokalisiert sind. Die RSA und RSF Transgene sind jedoch, verglichen mit den endogenen Igκ Allelen, weniger oft mit peri-zentromeren Heterochromatin (PHC), einem repressiven Chromatinareal, assoziiert. Anhand dessen was aus der Literatur bekannt ist, scheint für diese Beobachtung das Fehlen des Sis-Elements auf den Transgenen verantwortlich zu sein, welches die Assoziierung von endogenen Igk Allelen mit PHC unterstützt.


Kurzfassung in Englisch

The B cell antigen receptor (BCR) is composed of two identical heavy and two identical light chains. Two different isotypes of light chains exist and are utilized in a subsequent manner, first Igl and than Igl. The recombining sequence (RS) of mouse and its human equivalent, the kappa deleting element (KDE), are sequences found at the 3’ end of the Igk gene locus that rearrange RAG mediated to sites upstream of the Igk constant region (Ck). RS recombination inactivates the Igk locus and correlates with the onset of Igl expression. RS recombination could eliminate a putative repressor, which interferes with Igl. To test the model, two different transgenic mice, RSA and RSF were generated. The transgenic construct RSF spans the full 3’ end of Igk beginning with the Jk5 and ending with a mutated RS element, whereas the RSA construct lacks 11kb surrounding the Ed enhancer. The mutation should prevent RS recombination and thus, removal of the putative repressor. As a result, Igl locus rearrangements should be inhibited. However, no change in the ratio of Igk versus Igl expressing B cells was found in these mice. Transgenic B cells from several developmental stages reflected the wt situation with typically 5% of B cells expressing the Igl isotype. Thus, in this study it could be shown for the first time that the repressor model is probably not true.
Minor changes in overall B cell development in the transgenic mice were detected, whereupon a reduction of transgenic B1a cells was the most striking one. Furthermore, B1a cells failed to express the transgene properly. It was hypothesized, that the transgenic Igk loci compete with the endogenous loci for the binding of a limited amount of transcription factors and that B1a cells are most severely affected by the competition. Interestingly, the RSA transgenes lacking 11kb sequences surrounding the Ed enhancer were highly active in pro B cells, whereas the RSF transgenes were not transcribed in these cells. This suggests that an element located at the 11kb sequences encompassing Ed could be involved in silencing the endogenous Igκ locus in early B cells. Sequence analysis of this region from different species revealed three yet uncharacterized conserved regions that could contain such a potential element.
3D FISH analysis of transgene subnuclear positioning showed that the RSA and RSF transgenes were equally able to locate to the nuclear center in pre B cells like endogenous Igk alleles. However, the RSA and RSF transgenes display a reduced capacity to associate with the repressive pericentromeric heterochromatin compartment, which is probably due to the fact that they lack the silencer Sis.


SWD-Schlagwörter: Immunbiologie
Freie Schlagwörter (deutsch): B-Zellentwicklung
Freie Schlagwörter (englisch): B cell development
Institut 1: Max-Planck-Institut für Immunbiologie
Institut 2: Institut für Biologie 3
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Reth, Michael (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.09.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 08.10.2009
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