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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-68985
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6898/


Nguyen Quang Le

Fluorescent Bacillus subtilis biosensors for antimicrobial screening

Fluoreszierende Bacillus subtilis Biosensoren für eine antimikrobielle Screening Plattform

Dokument1.pdf (2.751 KB) (md5sum: 7050c548231cf2cb3f8dcc7b082b8b4b)

Kurzfassung in Englisch

The urgent need of novel antibiotics that target antibiotic resistant bacteria, especially gram positive bacteria, is requiring robust antimicrobial screening assays. The use of antibiotic inducible biosensors for high-throughput screening assays has become an attractive alternative approach to the classical target-based one. This thesis represents two complementary approaches for rational construction of Bacillus biosensors that can be applied in screening novel antibiotics against gram positive pathogens.
The first approach of generating antibiotic-inducible fluorescent biosensors yielded three promising biosensors. The first biosensor NL11 containing the promoter of yqiG was able to detect ribosome inhibitors. The green fluorescent protein (GFP) expression of this biosensor could be substantially induced by Chloramphenicol or Tetracycline; and reduced by Kanamycin , Neomycin, or Puromycin. The second biosensor NL10 having the promoter of wrpA was able to specifically detect cell wall inhibitors such as Cefotaxim, Cycloserin, and Vancomycin. Unspecific responses to Ciprofloxacin and Triclosan could be detected by the third biosensor NL12 having the promoter of alaR. The simultaneous detection of multiple biosensors is an exciting opportunity provided by flow cytometry. Therefore, when combined these biosensors in one cell-based assay, these unspecific responses can be excluded from further analysis.
The second approach for screening antimicrobials from natural product extracts yielded a robust, sensitive, and specific assay containing a bacterial mixture of different distinguishable biosensors. These biosensors all carried the constitutive promoter of rpmE gene but were either susceptible or resistant to Avilamycin (AVI). Two various resistant mechanisms for inactivating AVI employed in this assay allow to identify immediately mechanism of new AVI-like antimicrobials in soil bacteria extracts. Specifically, the result of screening Streptomyces natural product extracts confirmed distinct features of this assay. It could indicate a presence of antibacterial agents having similar AVI-like mode-of-action (MOA) in several natural product extracts of Streptomyces.
These Bacillus biosensors and the assays can be readily applied to high-throughput screening novel antimicrobials and antibiotic derivatives with a defined MOA. We believe that further studies apply our biosensors to screen compound libraries will result in good hits/leads in discovery of novel antimicrobials.


Kurzfassung in Deutsch

Aufgrund der dringenden Notwendigkeit von neuen Antibiotika, die gegen resistente Bakterien, insbesondere Gram-positive Bakterien, wirken benötigt man robuste Screening Verfahren. Antibiotika induzierbare Biosensoren in Hochdurchsatz Screening Verfahren sind eine attraktive Alternative zu den klassischen Ziel orientierten Verfahren. Diese Arbeit beschreibt zwei komplementäre Ansätze zur rationellen Herstellung von Bacillus Biosensoren, die im Screening nach neuen Antibiotika gegen Gram-positive Pahtogene genutzt werden können.
Der erste Ansatz zur Generierung von Antibiotika-induzierbaren fluoreszierenden Biosensoren ergab drei viel versprechende Biosensoren. Der Biosensor NL11, der den Promoter yqiG enthält, ist in der Lage ribosomale Inhibitoren anzuzeigen. Die Expression des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP) dieses Biosensors konnte signifikant durch Chloramphenicol oder Tetracykline erhöht und durch Kanamycin, Neomycin oder Puromycin erniedrigt werden. Der zweite Biosensor NL10 mit dem Promotor wrpA konnte Zellwandinhibitoren wie Cefotaxim, Cycloserin und Vancomycin anzeigen. Unspezifische Antworten auf Ciprofloxaxin und Triclosan konnten durch einen dritten Biosensor NL12 mit dem Promoter alaR detektiert werden. Die gleichzeitige Detektion mehrerer Biosensoren ist eine aufregende Möglichkeit, die die Durchflusszytometrie bietet. Dadurch können in einem Zell-basierenden Screen durch die Kombination dieser Biosensoren unspezifische Signale von einer weiteren Analyse ausgeschlossen werden.
Der zweite Ansatz für ein Antibiotika-Screen von Naturstoffextrakten ergab einen robusten, sensitiven und spezifischen Test, der eine Bakterienmischung aus verschiedenen unterscheidbaren Biosensoren enthält. Diese Biosensoren tragen alle den konstitutiven Promoter des rpmE Gens, sind aber entweder anfällig oder resistent gegen Avilamycin (AVI). Zwei verschiedene Resistenzmechanismen zur Inaktivierung von AVI, die in diesem Test eingebaut wurden, erlaubten es den Mechanismus von neuen AVI-ähnlichen Substanzen aus Bodenbakterienextrakten zu identifizieren. Die Ergebnisse aus einem Screen von Streptomyces Naturstoffextrakten bestätigten deutlich die Möglichkeiten dieses Tests. Er konnte die Anwesenheit von antibakteriellen Stoffen mit AVI-ähnlichen Mode-of-Action (MOA) in verschiedenen Streptomyceten Extrakten anzeigen.
Diese Bacillus Biosensoren und die Tests können in einem Hochdurchsatz Screening zur Detektion neuer Antibiotika mit definierten MOA angewendet werden. Wir glauben, dass aus weiteren Studien in denen unsere Biosensoren genutzt werden, um Kleinmolekülbibliotheken zu screenen, gute Leitstrukturen für die Entdeckung neuer Antibiotika resultieren.


SWD-Schlagwörter: -
Freie Schlagwörter (deutsch): -
Freie Schlagwörter (englisch): Bacillus subtilis, GFP, antimicrobial screening, biosensor
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Bechthold, Andreas (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 18.09.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 04.03.2010
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