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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-69686
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6968/


Holzer, Martin

Proteinvermittelter Lipidtransfer zwischen Liposomen zur Herstellung asymmetrischer Modellmembranen und die Rolle der Membranlipide bei der Organisation des T-Zellrezeptors

Protein-mediated lipid transfer between liposomes for the preparation of asymmetrical membrane models and the role of membrane lipids in the organization of the T cell receptor

Dokument1.pdf (8.325 KB) (md5sum: cf79883a3c1b0530649091ea8373dd76)

Kurzfassung in Deutsch

Das Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war die Entwicklung eines liposomalen Membranmodells, welches die asymmetrische Verteilung der Phospholipide (PL) auf die beiden Monolayer der Membran simuliert. Membranasymmetrie ist eine Eigenschaft vieler Zellmembranen und asymmetrische Liposomen sind wichtig, um die Rolle der Asymmetrie bei der Aufnahme von Liposomen in Zellen und der intrazellulären Prozessierung sowie bei der Bildung von Membrandomänen und der aktiven Modifizierung der Membrankurvatur zu verstehen. In physiologischen Vorgängen wie der Apoptose und der Blutgerinnung spielt die Asymmetrie anionischer PL (Phosphatidylserin) eine entscheidende Rolle.
Liposomen mit asymmetrischer Verteilung eines anionischen PL (statt Phosphatidylserin wurde aus Stabilitätsgründen Phosphatidylglycerol (PG) verwendet) wurden durch den proteinvermittelten Transfer von PG zwischen den äußeren Monolayern von PG-haltigen Donorliposomen und Akzeptorliposomen aus neutralem Phosphatidylcholin (PC) erhalten. Der Transfer wurde durch ein rekombinant hergestelltes pro-sterol carrier protein 2 (pro-SCP2) beschleunigt, um den Ausgleich der erzeugten Asymmetrie durch den PG-Flipp-Flopp (Diffusion zwischen den Monolayern) zu minimieren. Der Grad an Membranasymmetrie konnte aus dem elektrophoretischen Verhalten bei der Trennung von Akzeptor und Donor mit Hilfe der Free-Flow Elektrophorese (FFE) berechnet werden. Die Ablenkung in der FFE wird ausschließlich durch PG im äußeren Monolayer bestimmt. Dieser analytische Ansatz erlaubte zum ersten Mal die kinetische Untersuchung des PG-Transfers ohne die Einführung von Fluoreszenz- oder Spinlabel, welche den Transfer beeinflussen können. Der sehr langsame spontane Transfer von PG konnte durch Zusatz von pro-SCP2 in einem molaren Protein:Lipid-Verhältnis von 15-20∙10E-5 auf Halbwertszeiten im Bereich von 2-3 h beschleunigt werden. Damit wurde der Einfluss des PG-Flipp-Flopps auf die erzeugte Asymmetrie minimiert, da dieser mit Halbwertszeiten im Bereich von Tagen abläuft. Nach ca. 3 h Inkubationszeit konnten unter diesen Bedingungen asymmetrische Modellsysteme gewonnen werden.
Um zu beweisen, dass die Geschwindigkeit des pro-SCP2-vermittelten Transfers von der Membrankurvatur der Liposomen abhängt, wurden Detergensdialyse und präparative Größenausschlusschromatographie zu einer Methode kombiniert, mit der sich Liposomen von bisher nicht erreichter Größenhomogenität herstellen lassen (Variationskoeffizient des Durchmessers zwischen 13 und 25%). Zwischen Liposomen mit 50 nm Durchmesser verlief der pro-SCP2-vermittelte Transfer mit einer rund 60% höheren initialen Geschwindigkeit als zwischen 100 nm Liposomen. Es konnte gezeigt werden, dass zur Erzeugung einer einheitlichen Membranasymmetrie unilamellare und runde Liposomen von sehr enger Größenverteilung erforderlich sind.
Um den Transfer nicht-geladener Membrankomponenten analysieren zu können, wurde eine universell einsetzbare Methode auf Basis der Hochleistungsdünnschichtchromatographie entwickelt, mit welcher die fünf wichtigsten PL (PC, PG, Phosphatidylserin, -ethanolamin, -inositol) sowie Cholesterol, Fettsäuren und lyso-Phosphatidylcholin quantitativ erfasst werden können. Diese Methode wurde angewandt, um zu zeigen, dass ein künstliches Membranskelett (Simulation des Zytoskeletts) den pro-SCP2-vermittelten Transfer von PG verlangsamt und den spontanen Transfer von Cholesterol beschleunigt.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rolle der Membranlipide bei der Organisation des T Zellrezeptors (TCR-CD3) untersucht. T-Zellen regulieren ihre Sensitivität durch die Ausbildung von multivalenten TCR-Komplexen. Der Mechanismus dieser Oligomerisierung ist bisher unbekannt. In dieser Arbeit konnte der TCR erfolgreich in Liposomen rekonstituiert werden. Mit diesem System konnte bewiesen werden, dass nur in Liposomen, die sowohl Cholesterol als auch Sphingomyelin (SM) enthalten, multivalenter TCR gebildet wird. In reinen PC-Liposomen oder PC:Cholesterol- bzw. PC:SM-Liposomen wurde nur monovalenter TCR gefunden. Diese Beobachtung war für den TCR spezifisch, da in Kontrollversuchen mit dem Transferrin-Rezeptor keine Oligomerisierung auftrat. Vermutlich sind daher SM/Cholesterol-reiche Membrandomänen (lipid rafts) für die Organisation des TCR verantwortlich.
Die Möglichkeit, Proteine in asymmetrische Liposomen zu rekonstituieren, um den Einfluss der Asymmetrie auf die Membranproteine zu studieren und die funktionelle Rekonstitution der für die Asymmetrie der Zellmembran verantwortlichen Proteine (bspw. Flippasen) sind weiterführende Konzepte, die sich aus dieser Arbeit ergeben.


Kurzfassung in Englisch

The development of a liposome membrane model featuring an asymmetrical distribution of the phospholipids (PL) between the two membrane leaflets was the aim of the first part of the present thesis. Membrane asymmetry is found with a number of cells and asymmetrical liposomes are important tools for studying the role of asymmetry in the cellular uptake and intracellular processing of liposomes as well as in the formation of membrane domains or in the active modification of membrane curvature. The asymmetry of anionic phospholipids (phosphatidylserine) is involved in physiological processes such as apoptosis and blood coagulation.
Liposomes with an asymmetrical distribution of an anionic PL (phosphatidylglycerol (PG) was used instead of phosphatidylserine due to its higher chemical stability) were prepared by protein-mediated transfer of PG between the outer leaflets of PG-containing donor liposomes and acceptor liposomes made of neutral phosphatidylcholine (PC). Transfer was accelerated through the use of a recombinant pro-sterol carrier protein 2 (pro-SCP2) in order to minimize the influence of PG-flip-flop (diffusion between the two membrane leaflets) on asymmetry. The degree of asymmetry was calculated from the electrophoretic behavior of acceptor and donor liposomes when separated by means of free-flow electrophoresis (FFE). Deflection in FFE is exclusively determined by PG in the outer membrane leaflet. This approach allowed for kinetic analysis of PG transfer without introducing any reporter groups (fluorescence- or spin-label), which potentially influence the transfer rate. The very slow spontaneous transfer of PG was accelerated to half times of 2-3 hours by adding pro-SCP2 in molar protein-to-lipid ratios of 15-20∙10E-5. In this time-frame, asymmetry is not impacted by PG-flip-flop, which occurs at half times in the order of days. Under these conditions, asymmetrical liposomes were obtained after approximately 3 hours of incubation.
Detergent dialysis and preparative size exclusion chromatography were combined to prepare liposomes of very narrow size distribution (RSD of the diameter: 13-25%). These liposomes were used to demonstrate that the rate of pro-SCP2-mediated lipid transfer depends on membrane curvature. Transfer occurred with a 60% higher initial rate between liposomes of 50 nm diameter as compared to 100 nm vesicles. It was shown that unilamellar and spherical liposomes of as narrow a size distribution as possible are a prerequisite for achieving a uniform degree of asymmetry.
A different analytical approach is required to follow the transfer of uncharged membrane components. Therefore, a versatile high-performance thin layer chromatography method was established, which allows for the quantification of the five major PL (PC, PG, phosphatidylserine, -ethanolamine, -inositol) as well as cholesterol, fatty acids and lyso-PC in liposomes. This method was used to show that an artificial membrane skeleton (a cytoskeleton membrane model) reduces the rate of pro-SCP2-mediated PG transfer and accelerates the spontaneous transfer of cholesterol.
In the second part of the thesis, the role of membrane lipids in the organization of the T cell receptor (TCR-CD3) was investigated. The sensitivity of T cells is triggered by the formation of multivalent TCR complexes. The mechanism of oligomerization has remained unknown so far. After a successful reconstitution of the TCR into liposome membranes, it was demonstrated that multivalent TCR complexes are only formed in liposomes containing cholesterol as well as sphingomyelin (SM). In PC liposomes, PC:cholesterol- or PC:SM-liposomes, respectively, only monovalent receptor was found. Receptor oligomerization was a characteristic of the TCR, since no oligomerization was observed in control experiments with the transferrin-receptor. Therefore, SM/cholesterol-rich membrane domains (lipid rafts) are likely to contribute to the TCR organization.
Reconstitution of proteins in asymmetrical liposomes for studying the influence of asymmetry on membrane proteins and the functional reconstitution of proteins that are responsible for the maintenance of membrane asymmetry (e.g. flippases) are future concepts that result from the present work.


SWD-Schlagwörter: Liposom , Asymmetrie , Lipid-Carrier-Proteine , Freie Elektrophorese , Gelchromatographie , HPTLC , T-Lymphozyten-Rezeptor , Rekonstitution
Freie Schlagwörter (deutsch): Membranmodell , Membranasymmetrie , Lipidtransfer , Free-Flow Elektrophorese , Membrankurvatur
Freie Schlagwörter (englisch): membrane model , membrane asymmetry , lipid transfer , free-flow electrophoresis , membrane curvature
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Schubert, Rolf (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.10.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 12.11.2009
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