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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-69964
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6996/


Büttner-Mainik, Annette

Production of a new recombinant biopharmaceutical – human complement Factor H – in the moss Physcomitrella patens

Produktion eines neuen rekombinanten Biopharmazeutikums – humaner Komplementfaktor H – im Moos Physcomitrella patens

Dokument1.pdf (18.176 KB) (md5sum: 7af3542def0c5a6f0a700bfbaabfb7c7)

Kurzfassung in Englisch

The development of protein therapeutics is a steadily expanding field within the biopharmaceutical industry. Currently, the vast majority of biopharmaceuticals is produced in microbial or mammalian bioreactor systems. However, plants are rapidly emerging as an alternative production platform since they are able to perform most of the posttranslational modifications on complex processed proteins while being cost-effective and devoid of the risk of contaminations with human pathogens. The moss Physcomitrella patens is especially suitable as a production system for complex human biopharmaceuticals. It provides outstanding genetic accessibility and, at the same time, is economical and safe due to its autotrophic growth in axenic, scalable photo-bioreactors with the possibility of simplifying downstream processing through secretion of the protein of interest into a simple, mineral medium. The human complement regulatory protein Factor H (FH) represents a promising future biopharmaceutical. Defects in the gene encoding FH are associated with various human diseases such as severe kidney and retinal disorders in the form of atypical haemolytic uraemic syndrome, membranoproliferative glomerulonephritis II or agerelated macular degeneration. Application of purified or recombinant FH presents a promising future approach for the treatment of patients. However, neither protein purified from plasma of healthy individuals nor recombinant protein is currently available on the market. This is the first report of stable expression of full-length human FH in a plant system. The purified moss-derived recombinant FH displays complement regulatory activity equivalent to the human plasma purified protein as shown in a fluid-phase cofactor assay. Intracellular recombinant FH levels reached about 2 µg/g fresh weight and the protein was successfully secreted into the culture supernatant where it accumulated at concentrations of 0.2-0.5 µg/g fresh weight, i.e. 2-5 µg/L. As the plant cell wall (PCW) displays size exclusion properties for secreted recombinant proteins enzymatic pectin remodelling using endogenous pectin methylesterase (PME) may display a potent approach to loosen the PCW in a controlled manner. This thesis presents detailed sequence analyses together with tissue specific expression profiles of nineteen moss PME family members using microarray data are presented. Since recombinant protein production in P. patens is solely performed in protonema, the identification of PME isoforms expressed mainly in this tissue was of specific interest. Four genes encoding PMEs with predominant expression in protonema, PpPME 1, 2, 20, 24, and a constitutively expressed isoform with high similarity to an atypical PME from Arabidopsis, PpPME 12, are finally exposed as sensible targets in terms of directed PCW loosening to optimize the moss bioreactor. At this point, the FH producing plant line H3 generated here can serve as a future platform to specifically modulate PME expression in protonema and to monitor the effects of PCW remodelling on recombinant protein secretion.


Kurzfassung in Deutsch

Ein stetig expandierender Bereich in der biopharmazeutischen Industrie ist die Entwicklung von Proteintherapeutika. Die Mehrheit der Biopharmazeutika wird derzeit in Bioreaktoren mit Bakterien oder Säugetierzellen hergestellt. Mittlerweile werden jedoch auch zunehmend pflanzliche Systeme als Alternative etabliert, da sie nicht nur in der Lage sind komplex prozessierte Proteine mit allen wichtigen posttranslationalen Modifikationen zu versehen, sondern auch vergleichsweise kostengünstig sind sowie kein Risiko in Hinblick auf Kontaminationen mit Humanpathogenen bergen. Das Moos Physcomitrella patens stellt hierbei ein besonders geeignetes System dar. Zum einen ist es gentechnisch leicht zugänglich, zum anderen kann es unter sterilen Bedingungen autotroph in Photobioreaktoren, d.h. ökonomisch und sicher, kultiviert werden. Zudem kann die Reinigung des gewünschten rekombinanten Proteins stark vereinfacht werden, indem es in das einfache, mineralische Kulturmedium sezerniert wird. Das humane komplementregulatorische Protein Faktor H (FH) ist ein vielversprechender Kandidat für den Einsatz als Biopharmazeutikum.
Mutationen im für FH kodierenden Gen können zu schweren Krankheiten der Nieren oder der Augen führen, wie z.B. dem atypisch hämolytisch urämischem Syndrom, der membranoprolerativen Glomerulonephritis II oder der Altersblindheit. Die Behandlung von Patienten mit aufgereinigtem oder rekombinant hergestelltem FH ist ein vielversprechender Therapieansatz. Jedoch ist FH hierfür derzeit weder aus Plasma gereinigt noch rekombinant hergestellt erhältlich. In der vorliegenden Arbeit wird zum ersten Mal die erfolgreiche Herstellung von rekombinantem FH in einer Pflanze präsentiert. Der aus dem Moos gereinigte, rekombinanten FH zeigte eine mit dem humanen Protein vergleichbare Aktivität in einem Kofaktor-Flüssigphasen-Test. Intrazelluläre Konzentrationen des rekombinanten FH lagen
bei etwa 2 µg/g Frischgewicht, während das sezernierte Protein im Kulturüberstand Konzentrationen von 0.2–0.5 µg/g Frischgewicht, d.h. 2–5 µg/L, erreichte. Die pflanzliche Zellwand (ZW) stellt eine Barriere mit Größenausschluß für rekombinant sezernierte Proteine dar. Ein geeigneter Ansatz zur kontrollierten Lockerung des Netzwerks der ZW könnte in der Anwendung eines endogenen Enzyms liegen, welches speziell Pektinstrukturen der ZW umbaut – die Pektinmethylesterase (PME). In dieser Arbeit wird zum ersten Mal eine gewebespezifische Expressionsanalyse sowie eine detaillierte Sequenzanalyse von neunzehn Mitgliedern einer Moos PME-Familie beschrieben. Da die Produktion rekombinanter Proteine in P. patens ausschließlich im Protonema erfolgt, war dieser Gewebetyp bei den Untersuchungen von besonderem Interesse. Vier PME-Gene mit einer vornehmlichen Expression im Protonema (PpPME 1, 2, 20, 24) sowie eine konstitutiv exprimierte Isoform (PpPME 12) mit hoher Ähnlichkeit zu einer als atypisch charakterisierten PME aus Arabidopsis konnten als besonders geeignet mit Hinblick auf eine gerichtete ZW Modellierung ausgewiesen werden. Die in dieser Arbeit hergestellte, FH produzierende Mooslinie H3, kann nun zukünftig als Plattform dienen, um die Effekte einer veränderten PME-Expression im Protonema zusammen mit deren Auswirkungen auf die Ausschleusungseffizienz
eines komplexen rekombinanten Proteins zu bestimmen.


SWD-Schlagwörter: Physcomitrella patens , Zellwand , Rekombinante DNS , Bioreaktor
Freie Schlagwörter (deutsch): Biopharmazeutikum , Faktor H , AMD , MPGN II , aHUS
Freie Schlagwörter (englisch): recombinant , protein , biopharmaceutical , Factor H , plant cell wall
Institut: Institut für Biologie 2
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Reski, Ralf (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 04.12.2009
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