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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-69994
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/6999/


Kohlstädt, Markus

Funktionelle und strukturelle Untersuchungen zur NADH - Bindung der bakteriellen NADH:Ubichinon Oxidoreduktase

Functional and structural studies on the NADH binding of bacterial NADH:ubiquinone oxidoreductase

Dokument1.pdf (40.070 KB) (md5sum: 14b34a2463f5285744d11b5cd25db545)

Kurzfassung in Deutsch

Die protonenpumpende NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, die auch respiratorischer Komplex I genannt wird, ist das erste Enzym der Atmungsketten der meisten Eukaryoten und vieler Bakterien. Komplex I ist eines der größten und am kompliziertesten aufgebauten Membranproteine. Das Enzym koppelt die Elektronenübertragung von NADH auf Ubichinon mit einer Protonentranslokation über die Membran. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass Komplex I aus einem peripheren, hydrophilen und einem membranständigen, hydrophoben Teil aufgebaut ist. Die Struktur des hydrophilen Teils von Komplex I aus Thermus thermophilus wurde bei einer Auflösung von 3.3 Å in Abwesenheit von Substraten aufgeklärt, gab aber Hinweise auf die mögliche Bindung des Substrates NADH. Die Bindetasche enthält alle Elemente einer Rossmann-Faltung, allerdings in einer neuartigen räumlichen Anordnung. Innerhalb der vorhergesagten NADH-Bindestelle befindet sich ein konserviertes Phenylalanin, das keine Entsprechung in anderen NADH-bindenden Enzymen aufweist. Eine manuelle Anpassung von NADH in die Bindetasche wies darauf hin, dass dieses Phenylalanin möglicherweise die Bindung von NADPH, das kein Substrat für Komplex I ist, behindert.
Um zu untersuchen, ob dieses Phenylalanin der molekulare Schalter für die Unterscheidung von NADH und NADPH darstellt, sollte die Aminosäure in dem Komplex I aus Escherichia coli durch ortsgerichtete Mutagenese gegen andere Aminosäuren ausgetauscht und die kinetischen Parameter des nativen Komplex I und der Enzymvarianten bestimmt werden. Die Affinität des nativen Enzyms zu NADPH war etwa 400-500 mal geringer als zu NADH. Die Mutation des Phenylalanins führte in den meisten Fällen zu einer geringeren Affinität und Reaktionsgeschwindigkeit mit NADH als Substrat. Die Varianten mit einem Histidin oder Tyrosin an dieser Position zeigten eine 1.5 - 2-fach höhere Affinität zu NADPH, wahrscheinlich aufgrund der Stabilisierung der zusätzlichen 2'-Phosphatgruppe durch Coulomb- oder Wasserstoffbrückenwechselwirkungen. Die Umsatzgeschwindigkeiten blieben jedoch im Rahmen der Messgenauigkeit unverändert, so dass ausgeschlossen wird, dass das Phenylalanin eine Schlüsselfunktion bei der Substraterkennung hat.

In der Literatur wurde beschrieben, dass das lösliche Elektroneneingangsmodul des Komplex I aus dem hyperthermophilen Eubakterium Aquifex aeolicus bei hohen Temperaturen und in Gegenwart von SDS stabil ist, was diesen Subkomplex zu einem guten Kandidaten für Kristallisationsversuche macht. Die Wachstumsraten des Bakteriums und die Proteinausbeuten bei der Präparation des Komplexes sind jedoch sehr gering.
In dieser Arbeit sollten daher verschiedene Expressionssysteme erstellt werden, um die für Komplex I aus A. aeolicus codierenden Gene heterolog in E. coli zu exprimieren. Die Expression der Gene, die für die drei Untereinheiten des Elektroneneingangsmoduls kodieren, führte zur Assemblierung des löslichen Subkomplexes NuoEF, der ein Flavinmononukleotid (FMN), zwei Eisen-Schwefel-Zentren sowie die NADH-Bindestelle enthält. Die dritte Untereinheit des Elektroneneingangsmoduls, NuoG, wurde lediglich in Form von Einschlusskörpern produziert. Der Subkomplex NuoEF wurde isoliert, proteinchemisch charakterisiert, kristallisiert und seine Struktur bei einer Auflösung von 2.0 Å bestimmt. Ein Vergleich mit der Struktur der homologen Untereinheiten aus T. thermophilus zeigte keine wesentlichen Unterschiede in der Proteinfaltung. Allerdings wurde die Konformation des FMN bei der erreichten Auflösung eindeutig bestimmt. Sie zeigt eine planare Anordnung des Isoalloxazin-Ringes, der in der Struktur des T. thermophilus Komplexes geknickt dargestellt ist. Es gelang, die Struktur des Subkomplexes mit gebundener ADP-Ribose bei einer Auflösung von 2.0 Å zu lösen. Die Daten wurden aus Kokristallisationsexperimenten mit NADH erhalten, die Elektronendichte des Nicotinamid-Ringes war jedoch nicht zu bestimmen. Die Proteinstruktur unterscheidet sich nur unwesentlich von der des nativen Enzyms und zeigt erstmalig die Bindung von NADH in der Bindestelle von Komplex I. Aufgrund der ungewöhnlichen Anordnung der Elemente der Rossmann-Faltung bindet NADH in einer Konformation, die bisher nicht beschrieben wurde. Anhand dieser Struktur zeigte sich, dass das oben beschriebene konservierte Phenylalanin lediglich an der Bindung des Adenins beteiligt ist.


Kurzfassung in Englisch

The proton pumping NADH:ubiquinone oxidoreductase, also termed respiratory complex I, is the first enzyme of respiratory chains of most eukaryotes and many bacteria. Complex I is one of the largest and most intricate membrane proteins. The enzyme couples the electron transfer from NADH to ubiquinone with a proton translocation across the membrane. Electron microscopic studies show that complex I is composed of a peripheral, hydrophilic and a membrane bound, hydrophobic part. The structure of the hydrophilic part of complex I from T. thermophilus has been resolved at a resolution of 3.3 Å without substrate and gave hints on the possible binding of the substrate NADH. The binding pocket contains all elements of a Rossmann fold, but in a novel spacial arrangement. One conserved phenylalanine with no counterpart in other NADH binding enzymes is present within the predicted NADH binding pocket. A manual fit of NADH into the binding pocket showed that this phenylalanine could hamper the binding of NADPH, which is no substrate for complex I. To test whether the phenylalanine is a molecular switch for the discrimination between NADH and NADPH, the corresponding amino acid in the Escherichia coli complex I was exchanged against other amino acids by site directed mutagenesis and the kinetic parameters of the native complex I and the enzyme variants were determined. The affinity of native enzyme to NADPH was approximately 400-500 times lower compared with the affinity to NADH. In the majority of cases, the mutation of the phenylalanine led to a lower affinity and reaction rate with NADH as substrate. The variants with histidine or tyrosine at this position showed a 1.5 - 2 fold higher affinity to NADPH, probably due to the stabilization of the additional 2'-phosphate group by coulomb or H-bond interactions. However, the reaction rates were not changed within the accuracy of measurements, so that a key function of the phenylalanine in substrate recognition is excluded.
The soluble electron entry module of complex I from the hyperthermophilic eubacterium Aquifex aeolicus is stable at high temperatures and in the presence of SDS, making this subcomplex a suitable candidate for crystallization experiments. Both the growth rate of the bacteria and protein yield after preparation of the complex are very low, however. In this work, several systems for the heterologous expression of genes coding for A. aeolicus complex I in E. coli were constructed. Expression of the three genes coding for the electron entry module led to the assembly of a soluble subcomplex NuoEF, harbouring one flavine mononucleotide (FMN), two iron-sulfur clusters and the NADH binding site. The third subunit of the electron entry module, NuoG, was solely produced as inclusion bodies. The subcomplex NuoEF was isolated, characterized, crystallized and its structure resolved at a resolution of 2.0 Å. A comparison with the structure of the homologous subunits from T. thermophilus shows no considerable differences in the protein fold. However, the conformation of the FMN at this resolution was resolved unambiguously. The isoalloxazine ring is arranged in a planar way, where in the structure of the T. thermophilus complex it is shown bent. The structure of the subcomplex was also resolved with bound ADP-ribose at 2.0 Å resolution. Data were obtained after cocrystallization with NADH, the electron density of the nicotineamide moiety could not be determined, however. The protein structure differed only marginally from the one of the native complex and shows the binding of NADH to the binding pocket of complex I for the first time. Due to the unusual arrangements of the Rossmann fold elements, NADH binds in a novel conformation. On the basis of this structure it was shown that the conserved phenylalanine mentioned above merely is involved in binding the adenine moiety of the substrate.


SWD-Schlagwörter: NADH-Dehydrogenase <Ubichinon> , NADH:Ubichinon Oxidoreduktase , Aquifex aeolicus , Kristallstruktur , Ortspezifische Mutagenese
Freie Schlagwörter (englisch): NADH-Dehydrogenase <ubiquinone> , NADH:ubiquinone oxidoreduktase , Aquifex aeolicus , Crystal structure , Site specific mutagenesis
Institut: Institut für Organische Chemie und Biochemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Friedrich, Thorsten (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.11.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 05.07.2010
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