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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-70123
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/7012/


Burmester, Illip

Entwurf und Selektion von EGF-R spezifischen Peptiden, sowie Generierung und Charakterisierung von Peptid-Enzym-Fusionen für die zielgerichtete Lokalisation am epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor

Design and selection of EGF-R specific peptides, as well as generation and characterization of peptide-enzyme-fusions for specific targeting of the EGF-R

Dokument1.pdf (4.470 KB) (md5sum: 66ac647c731e5c0238117b8a00680e5c)

Kurzfassung in Deutsch

Die zentrale Bedeutung des EGF-R bezüglich der Regulation zellulärer Kernprozesse (Proliferation, Differenzierung, Migration, anti-Apoptose, etc.) bildete die Grundlage für die Entwicklung zahlreicher EGF-R basierter Therapieansätze. Einige Tyrosinkinaseinhibitoren und EGF-R Familien spezifische Antikörper wurden bereits für die Behandlung von Tumoren in Europa und den USA zugelassen. In der vorliegenden Arbeit sollte die grundlegende Möglichkeit der Verwendung kleiner Peptide als spezifisch bindende Module für die Fusion mit enzymatisch aktiven Proteingerüsten ausgelotet werden. Im semi-rationalen Ansatz wurden aus einer scFv 425 basierten Genbibliothek mittels Phage
Display Peptide isoliert, die den EGF-R spezifisch binden sollten. Phagenklone aus der letzten Selektionsrunde zeigten in ELISA Experimenten auf immobilisiertem sEGF-R und auf A431 Zellen ein deutliches Bindungssignal. Den isolierten Sequenzen war ein charakteristisches HXX-Tripeptidmotiv gemeinsam. Die Struktur des parentalen Antikörpers mAK 425 zeigte rückversichender weise exponierte Histidinseitenketten in zwei CDR- Schleifen. Die Ergebnisse der Selektion erschienen daher konsistent. Durch die Fusion der selektierten Peptidsequenz SSHIFTF an das trimere Enzym Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT) wurde ein Fusionsprotein generiert (S-CAT-S) und auf EGF-R spezifische Interaktion getestet. In Abhängigkeit der angewandten Methode konnte eine spezifische Lokalisation des S-CAT-S Fusionsenzyms am EGF-R nicht zweifelsfrei nachgewiesen werden. Mittels ELISA und konfokaler Immunfluoreszenz konnte eine Bindung nachgewiesen werden, zeigte jedoch leichten unspezifischen Hintergrund.
Mittels Durchflusszytometrie und BIAcore konnte dagegen keine Bindung an A431 Zellen bzw. an sEGF-R nachgewiesen werden. Die Neigung des CATwt Enzyms zu unspezifischer Bindung und die mutmaßlich geringe Affinität des Peptids könnten für die beobachteten Phänomene ursächlich gewesen sein. Eine potentielle Bindestelle des Peptids SSHIFTF konnte unter Verwendung des Programms
AutoDock4 berechnet werden, die mit den experimentellen Ergebnissen und Daten aus der Literatur konform war. Die berechnete Konformation zeigte das Peptid in einer Interaktion mit dem EGF-R unter bedeutender Beteiligung des Histidins, welches in auffälliger Weise als Tripeptidmotiv in allen angereicherten Phagenklonen aus der Selektion präsent war. Für den parentalen Antikörper mAK 425 wurde eine Kompetition mit dem natürlichen Liganden EGF beschrieben. Mit dieser Beobachtung konform zeigte die gerechnete Konformation das Peptid, welches aus der CDR L3 entstammt, in unmittelbarer räumlicher Nähe zur EGF-
Kontaktstelle. In einem weiteren Projekt wurde die hypervariable Schleife der schweren Kette des mAK 425 (CDR H3) als bindendes Modul abgeleitet, da diese CDR bei vielen Antikörper-Antigen Kontakten den größten Beitrag zur Bindung leistet, und an das CAT Enzym fusioniert (H3-CAT-H3). Eine CDR H3 vermittelte Bindung des H3-CAT-H3 Fusionsproteins an den EGF-R konnte weder mittels ELISA und konfokaler Immunfluoreszenz, noch mittels BIAcore nachgewiesen werden.
Die Analyse der Kristallstruktur des EGF-R offenbarte einen weiteren potentiellen Angriffspunkt für die Entwicklung eines EGF-R Inhibitors. Ein Teil der Domäne II, auch Dimerisierungsarm bezeichnet, ist an zwei, für die Rezeptoraktivierung, wesentlichen Interaktionen beteiligt. Die intramolekulare Interaktion mit der Domäne IV hält den Rezeptor in der inaktiven Konformation, während die intermolekulare Interaktion mit dem Dimerisierungsarm einer weiteren Domäne II den Großteil der Interaktionsfläche im aktiven Rezeptordimer ausmacht. Eine Bindung des Dimerisierungsarms (MYNLPTTQMDV) konnte mittels ELISA, BIAcore und Durchflusszytometrie nicht nachgewiesen werden, was erwartet werden konnte, da der Dimerisierungsarm in beiden möglichen (aktive und inaktive) Konformationen unzugänglich vorliegt. Im Wundheilungsexperiment mit A431 Zellen konnte bei Koinkubation von EGF und Dimerisierungsarm eine Reduktion der EGF induzierten Stimulation auf das Niveau der Mediumkontrolle beobachtet werden. Bei alleiniger Inkubation mit dem Dimerisierungsarm wurde die intrinsische Proliferationsrate der A431 Zellen auf ein Maß unter der Mediumkontrolle reduziert. Mit den experimentellen Ergebnissen konform könnte folgender Wirkmechanismus postuliert werden: Nach EGF induzierter Rezeptorumlagerung wird für kurze Zeit die Domäne II exponiert und kann durch den Dimerisierungsarm gebunden werden, was eine Dimerisierung mit einem zweiten aktiven Rezeptor und folglich die Aktivierung unterbinden könnte. Ohne EGF induzierte Exponierung der Domäne II könnte das Peptid dagegen nicht an den EGF-R binden, da die Domäne II in der autoinhibierten, unzugänglichen Konformation vorläge.


Kurzfassung in Englisch

The epidermal growth factor receptor (EGF-R) is involved in the regulation of key cellular processes (proliferation, differentiation, migration, anti-apoptosis) and has become a major target for tumor therapy. Few antibody based therapeutics and tyrosine kinase inhibitors have been developed and finally approved by the FDA for treatment of tumors to date.
In this work, we addressed the potential use of small peptides as binding modules in enzyme peptide fusions.
In a semi-rational approach peptides were selected from a scFv425 based gene library using phage display technology.
Phages from the last selection round revealed a binding signal on both, immobilized sEGF-R and EGF-R over-expressing A431 cells in ELISA experiments. All isolated sequences showed a HXX tripeptide motif. Reassuringly, the modeled structure of the parental monoclonal antibody 425 (mAb425) showed two His residues exposed in the antigen contact area.
A hexavalent fusion protein (S-CAT-S) was generated fusing the SSHIFTF peptide sequence to both termini of the homo-trimeric enzyme Chloramphenicol Acetyl-Transferase (CAT) and tested for specific interaction with the EGF-R. A specific EGF-R binding for the fusion enzyme S-CAT-S could be shown with some, but not all techniques. In ELISA and confocal immunofluorescence an EGF-R binding could be shown, albeit with some background signal. Using flow cytometry and surface plasmon resonance technology, we were not able to show either sEGF-R specific binding or binding to A431 cells. Low affinity of the peptide and the tendency of the CATwt to show substantial background signals might be an explanation for the observed binding data.
A potential binding site of the SSHIFTF peptide on the EGF-R ecto-domain was computed using AutoDock4. The identified binding site was compatible with the experimental results and literature data. The docked conformation of the peptide showed the His residue in an important interaction with residues from the EGF-R. The parental mAb425 was reported to compete with the natural ligand EGF for binding. This observation is in agreement with the computed binding site in close proximity to the EGF contact site.
In a further project, a peptide was derived from the mAb425 hypervariable loop H3 (CDR H3) as a putative binding module. Some EGF-R specific peptides have previously been isolated from the CDR H3 of EGF-R specific antibodies where this loop contributed most to the binding strength of the antibody. This CDR H3 was fused to the N- and C-termini of the CAT enzyme to yield the H3-CAT-H3 fusion enzyme. A EGF-R specific binding could not be demonstrated using either ELISA, confocal immunofluorescence or suface plasmon resonance technology.
The structure of the EGF-R itself revealed another possibility for the development of an EGF-R specific inhibitor and binding module. A very prominent structure of domain II the so called “dimerization arm” is crucially involved in the inter- and intramolecular interaction of the auto-inhibited receptor and two activated receptors, respectively. Binding of the peptide (MYNLPTTQMDV) to sEGF-R could not be demonstrated in ELISA, surface plasmon resonance and flow cytometry, which might be attributable to steric hinderances. Co-incubation of the peptide and EGF in wound healing experiments reduced the EGF induced activation of A431 cells to levels comparable to cells treated with medium only. Incubation of the peptide alone resulted in a inhibition of the wound closure below values of medium control treated cells.


SWD-Schlagwörter: Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor , Phagen-Display-Bibliothek
Freie Schlagwörter (deutsch): Wirkstoffaktivierungstherapie , Peptiddesign , Tumortherapie
Freie Schlagwörter (englisch): prodrug activation therapy , peptide design , epidermal growth factor receptor, peptide-enzyme fusion
Institut: Institut für Biologie 3
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Müller, Kristian (Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2009
Erstellungsjahr: 2008
Publikationsdatum: 15.01.2010
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