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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-71207
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/7120/


Jung, Julia

Delta9-Tetrahydrocannabinolsäure A – ein neuer Cannabis-Konsum-Marker

Delta9-Tetrahydrocannabinolic acid A – a new marker for cannabis consumption

Dokument1.pdf (1.273 KB) (Dissertation) (md5sum: 33d45a5b3cbe9ec45f1ae41b694839d2)

Kurzfassung in Deutsch

Mit Delta9-THCA-A (THCA-A) wurde ein neuer, potentieller Cannabis-Konsum-Marker etabliert, welcher die in der forensischen Praxis bislang zur Anwendung kommenden Ansätze und Berechnungsmodelle zur Abschätzung des Zeitpunkts des letzten Cannabis-Konsums, zur Beurteilung einer akuten Cannabis-Wirkung sowie zur Einschätzung des Konsumverhaltens sinnvoll erweitern kann.
Während der Untersuchung von Rauchkondensaten auf quantitativ relevante Cannabinoide und deren Abbauprodukte kristallisierte sich THCA-A, der nicht psychoaktive, biogenetische Vorläufer von Delta9-THC (THC), als Zielsubstanz heraus. Entgegen der bisherigen Annahme, dass THCA-A spätestens beim Rauchen oder Backen durch Decarboxylierung vollständig in THC umgewandelt wird, wurden relevante Mengen an THCA-A in Rauchkondensaten von Haschisch und Marihuana nachgewiesen. Daraufhin wurden Proben von Cannabis-Konsumenten mittels LC-ESI-MRM auf den potentiellen Cannabis-Konsum-Marker untersucht, wobei erstmals der Nachweis von THCA-A in Serum und Urin von Cannabis-Konsumenten gelang. Anschließend wurde die Labor-interne Standard-GC-MS-Methode so erweitert, dass diese die gleichzeitige Bestimmung von THCA-A, THC, 11-OH-Delta9-THC sowie Delta9-THC-COOH erlaubt. Die Untersuchung von 200 Serumproben mit der so angepassten Methode zeigte, dass in mehr als 80 % der bestätigten Cannabis-Fälle ebenfalls THCA-A nachgewiesen werden kann. In keinem der untersuchten Fälle wurde dagegen bei negativem Cannabis-Befund THCA-A detektiert. Seit Mitte 2007 stand eine Aufrüstung des zuvor eingesetzten GC-MS zum GC-MS/MS zur Verfügung, dessen Anwendbarkeit für die Quantifizierung von Cannabinoiden und Potential zur Empfindlichkeitssteigerung v.a. hinsichtlich der Bestimmung von THCA-A untersucht wurde. Das GC-MS/MS erlaubte eine deutliche Verkürzung der gaschromatographischen Trennmethode, so dass eine Gesamtmesszeit von weniger als 10 min bei gleich bleibend guten Nachweis- und Bestimmungsgrenzen erzielt werden konnte. Aufgrund einer sehr effektiven SPE sowie eines optimierten GC-Temperaturprogramms konnte jedoch keine Empfindlichkeitssteigerung erreicht werden.
Da für Untersuchungen zum Metabolismus und zur Eliminationskinetik von THCA-A größere Mengen erforderlich waren und alle in der Literatur beschriebenen Methoden zur Isolierung von THCA-A entweder kostenintensive Materialien oder toxische Lösungsmittel einsetzten, wurde ein neues Verfahren entwickelt. Die Trennung eines durch Kaltauszug gewonnenen Rohextraktes mittels klassischer Säulenchromatographie ermöglichte die Extraktion größer Mengen THCA-A aus Marihuana mit hoher Reinheit. In Spuren verbliebenes THC wurde anschließend mittels semipräparativer HPLC-DAD abgetrennt und die THC-freie THCA-A wieder aus dem Laufmittelgemisch extrahiert.
Anschließend erfolgte eine Studie am Rattenmodell zur Strukturaufklärung von THCA-A-Metaboliten und zur Prüfung, ob eine metabolische Umwandlung von THCA-A zu THC erfolgt. Mittels LC-ESI-MS/MS und LC-QTOF MS wurden im Rattenurin insgesamt zwölf THCA-A-Metabolite identifiziert: Hydroxlierung zu 11-OH-Delta9-THCA-A und anschließende Oxidation zu Delta9-THCA-A-COOH dominieren den Phase-I-Metabolismus. Daneben erfolgen Hydroxlierungen zu 8alpha-OH-Delta9-THCA-A und 8beta-OH-Delta9-THCA-A, gefolgt von einer Dehydrierung zu Delta9-THCA-A-8-on. Diese Metabolite werden ferner in Position 11 zu 8alpha,11-Bis-OH-Delta9-THCA-A und 8beta,11-Bis-OH-Delta9-THCA-A weiter oxidiert. Die Glucuronidierung dieser Metabolite stellt die Hauptkonjugationsreaktion im Phase-II-Metabolismus dar. Es ergaben sich keine Hinweise auf metabolische Umwandlung von THCA-A zu THC. Im zweiten Abschnitt wurde der humane Metabolismus untersucht. Zusätzlich wurden die durch Hydroxylierung von Delta9-THCA-A-COOH in Position 8 bzw. 4’ der Seitenkette entstehenden 8-OH-Delta9-THCA-A-COOH und 4’-OH-Delta9-THCA-A-COOH sowie das durch Epoxidierung der olefinischen Doppelbindung entstehende Epoxy-HHCA-A identifiziert, welches aufgrund seiner Instabilität umgehend zu 9,10-Bis-OH-HHCA-A hydrolysiert wird. Untersuchungen mit Rattenlebermikrosomen gezeigten, dass die entsprechenden Funktionalisierungsreaktionen durch mikrosomale Enzyme vom CYP-P-450 Typ katalysiert werden.
Nachfolgend wurde das Eliminationsverhalten von THCA-A und dessen Metaboliten nach oraler Aufnahme von THCA-A untersucht, wobei Unterschiede in den Konzentrations-Zeit-Profilen von THCA-A und Metaboliten sowie THC beobachtet wurden. Aus den Ergebnissen wurde abgeleitet, dass für THCA-A die orale Bioverfügbarkeit deutlich höher ist, der First-Pass-Metabolismus schwächer ausgeprägt ist und die Umverteilung in das Fettgewebe in deutlich geringerem Ausmaß stattfindet. Sollte sich in Probandenstudien bestätigen, dass im Serum relevante THCA-A-Konzentrationen nur innerhalb eines kurzen Zeitfensters nach einem Konsum nachweisbar sind, liegen ideale Voraussetzungen für einen Cannabis-Konsum-Marker vor.


Kurzfassung in Englisch

Delta9-THCA-A (THCA-A) was introduced as a potential new marker for cannabis consumption which could supplement the approaches and calculation models currently used in forensic science for the estimation of the time of last cannabis consumption, for the assessment of an acute cannabis impact and for the evaluation of the consumer behaviour.
Condensates of marijuana and hashish smoke were screened for relevant amounts of cannabinoids and their degradation products. Thereby THCA-A, the non-psychoactive, biogenetic precursor of Delta9-THC (THC), became apparent as target substance for further investigation. Contrary to the present assumption that THCA-A is completely converted to THC during smoking or baking by decarboxylation, relevant amounts of THCA-A were detected in condensates of marijuana and hashish smoke. Thereupon sample of cannabis consumers were screened for the potential cannabis consumption marker whereas THCA-A was detected in serum and urine of cannabis consumers for the first time. Afterwards the in-house standard GC-MS method was extended and therefore allowing the simultaneous determination of THCA-A, THC, 11-OH-Delta9-THC and Delta9-THC-COOH. The analysis of 200 serum sample with the adapted method showed that more than 80 % of the confirmed cases were also positive for THCA-A. In non-confirmed cases, THCA-A was not detected. Since summer 2007 an upgrade of the before used GC-MS to GC-MS/MS was available. Its applicability for the quantification of cannabinoids and potential for sensitivity enhancement especially regarding the determination of THCA-A was tested. Using GC-MS/MS a noticeable reduction of the gas-chromatograhic separation method was possible resulting in a total run time of less than ten minutes with unchanged limits of detection and quantification, respectively. Due to a highly effective SPE and an optimized GC temperature program a sensitivity enhancement could not be achieved.
For studies on the metabolism and elimination kinetics of THCA-A larger amounts were needed, but all method for the isolation of THCA-A described in literature used either expensive materials or toxic solvents. Therefore a new method for the isolation of THCA-A was developed. The separation of a crude extract, which was obtained by maceration, using a conventional column chromatography allowed the extraction of large amounts of THCA-A from marijuana in high purity. Trace amounts of THC were subsequently removed by a semi-preparative HPLC-DAD and the THC-free THCA-A was re-extracted from the HPLC solvent.
For the determination of the molecular structure of THCA-A metabolites and for the examination, if a metabolic conversion of THCA-A to THC occurs, a study using a rat model was performed. Using LC-ESI-MS/MS and LC-QTOF MS twelve metabolites of THCA-A were identified in rat urine: Hydroxylation to 11-OH-Delta9-THCA-A and subsequent oxidation to Delta9-THCA-A-COOH dominate the phase-I-metabolism. In addition hydroxylations to 8alpha-OH-Delta9-THCA-A and 8beta-OH-Delta9-THCA-A followed by dehydration to Delta9-THCA-A-8-on occur. Both metabolites were further oxidized in position 11 to 8alpha,11-Bis-OH-Delta9-THCA-A and 8beta,11-Bis-OH-Delta9-THCA-A. Glucuronidation of these metabolites is the main conjugation reaction in the phase-II-metabolism. In vivo conversion of THCA-A to THC was not observed. Afterwards the human metabolism was investigated. Additionally 8-OH-Delta9-THCA-A-COOH and 4’-OH-Delta9-THCA-A-COOH as well as Epoxy-HHCA-A were identified. 8-OH-Delta9-THCA-A-COOH and 4’-OH-Delta9-THCA-A-COOH are generated by hydroxylation of Delta9-THCA-A-COOH in position 8 and 4’ of the side chain, respectively. Epoxy-HHCA-A, which is immediately hydrolyzed to 9,10-Bis-OH-HHCA-A due to its instability, is formed by an epoxidation of the olefinic double bond. Studies with rat liver microsomes showed that the correspondent functionalization reactions are catalyzed by microsomal enzymes of the CYP-P-450 type.
Afterwards the elimination of THCA-A and its metabolites after oral application of THCA-A was studied. Differences in the concentration-time profiles of THCA-A and its metabolites in comparison to THC were observed. From these results it was deducted that for THCA-A the oral bioavailability is higher, the first-pass-metabolism is less pronounced and the redistribution into fat tissue occurs to a less extent.
If a study including more individuals confirms that relevant serum concentrations of THCA-A can only be detected in a short time window after cannabis use, ideal prerequisites for a cannabis consumption marker are existent.


SWD-Schlagwörter: Metabolismus , Elimination , GC-MS
Freie Schlagwörter (deutsch): Cannabis , Delta9-Tetrahydrocannabinolsäure A , GC-MS/MS , LC-MS/MS , LC-QTOF MS
Freie Schlagwörter (englisch): Cannabis , Delta9-Tetrahydrocannabinolic acid A , GC-MS/MS , LC-MS/MS , LC-QTOF MS
Institut: Inst. für Rechtsmedizin
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Weinmann, Wolfgang (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.11.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 04.01.2010
Bemerkung: Teile der Arbeit wurden in folgenden Publikationen veröffentlicht: J. Jung, J. Kempf, H. Mahler, W. Weinmann. Detection of delta9-tetrahydrocannabinolic acid A in human urine and blood serum by LC MS/MS. Journal of Mass Spectrometry. 2007; 42(3): 354-60. J. Jung, M. R. Meyer, H. H. Maurer, C. Neusüß, W. Weinmann, A. Auwaerter. Studies on the metabolism of the delta9-tetrahydrocannabinol precursor delta9-tetrahydrocannabinolic acid A (delta9-THCA A) in rat using LC-MS/MS, LC-QTOF MS and GC-MS techniques. Journal of Mass Spectrometry. 2009; 44(10): 1423-33.
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