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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-71702
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/7170/


Gajer, Markus

Untersuchung der Interaktion des RNA-Enkapsidierungssignals e von DHBV mit dem viralen P-Protein

Studying the interactions of the RNA encapsidation signal e of DHBV with the viral P protein

Dokument1.pdf (23.768 KB) (md5sum: f292f4a787928dfdad6fca278543137e)

Kurzfassung in Deutsch

Das Hepatitis B-Virus (HBV) gehört zu einer Familie kleiner umhüllter hepatotroper DNA Viren, die alle über reverse Transkription der prägenomischen RNA (pgRNA), replizieren. Eine zentrale Rolle im Replikationszyklus spielt die Interaktion der viralen Reversen Transkriptase (P-Protein) mit der Haarnadelstruktur e nahe dem 5´-Ende der pgRNA; sie vermittelt die Verpackung der RNA in das Nukleokapsid und auch die Initiation der DNA-Synthese durch Protein-Priming. Die Information für die Wahl der richtigen Startstelle des Oligonukleotides muss im Komplex aus P-Protein und eRNA selbst enthalten sein.
Für das Enten-HBV (DHBV) lassen sich Priming-aktive Komplexe in vitro rekonstituieren und Enten können in vivo mit DHBV infiziert werden; rekombinante Viren sind durch Transfektion einer Zelllinie zugänglich. Der Einfluss der DHBVe (De) RNA-Sequenz kann biochemisch auf die Priming-Aktivität und Replikationsfähigkeit mutierter Viren in Zellkultur und in vivo untersucht werden. Frühere in vitro Untersuchungen zeigten, dass die e-Elemente von HBV und DHBV aus einem unteren und oberen Stamm, eine ungepaarte bulge-Region, die als Matrize für den Oligonukleotid-Primer dient, und einem apikalem loop bestehen; der obere Stamm ist fast durchgehend basengepaart, was als Hinweis auf eine funktionelle Bedeutung dieser Basenpaarung galt. Auch Varianten mit veränderter Sequenz in diesem Bereich, die keine Basenpaarung zulassen, können in vitro aktive Komplexe bilden und die Replikation unterstützen. Die Hypothese dieser Arbeit war, dass, wenn nicht die spezifische Sequenz oder Basenpaarung, dann die Anzahl der Nukleotide funktionell bedeutsam ist, indem sie den Abstand zwischen bulge und loop definiert und zur Positionierung der TP-Domäne über der Startstelle auf der RNA-Matrize dient. Es wurden zwei Klassen von De RNA-Varianten mit veränderter Länge des oberen Stammes konstruiert; Klasse I-Varianten waren um bis zu 4 Nt verlängert oder verkürzt, Klasse II-Varianten enthielten eine zusätzliche Deletion von 6 Nt im oberen Stamm. Alle De-Sequenz-Varianten wurden auf in vitro Aktivität getestet, in komplette Virusgenome inkorporiert und per Transfektion auf Replikationsfähigkeit, und auf Infektiösität in primären Entenhepatozyten und in vivo getestet. Selbst massivste Veränderungen führten nicht zu komplettem Aktivitätsverlust, abhängig vom Testsystem wurden unterschiedlich ausgeprägte Unterschiede zur wt-Sequenz und zwischen den Varianten sichtbar. In vitro zeigten fast alle Klasse I-Varianten höhere Priming-Aktivitäten als die wt-RNA; Klasse II-Varianten mit zusätzlichen Deletionen ergaben die schwächsten Signale, Insertionen konnten dies zum Teil ausgleichen. Durch Verwendung unterschiedlicher markierter dNTPs als Primer-Bausteine konnte gezeigt werden, dass die Effizienz, nicht aber Spezifität des Primer-Synthesestarts betroffen war. In transfizierten Zellen waren die Replikationseffizienzen weniger unterschiedlich; die in vitro aktiveren RNA-Sequenzen replizierten nicht besser als das wt-Virus; selbst die nur schwach aktiven Klasse II-Varianten ergaben gut nachweisbare Mengen an Nachkommen DNA. Das lässt darauf schließen, dass das wt-Virus mit höchstmöglicher Effizienz repliziert oder dass sowohl Vorteile wie Nachteile individueller RNA-Varianten durch in vitro fehlende Zellfaktoren ausgeglichen werden. In allen Fällen hatte die (-)-Strang-DNA das authentische 5´-Ende; keine der Modifikationen führte zu einer Verschiebung der Startstelle des Oligonukleotid-Primers. Die stärksten Unterschiede traten bei der Infektion von Hepatozyten und in vivo auf. Nur eine der Varianten erreichte hier eine annähernd dem wt vergleichbare Infektiösität, alle anderen zeigten deutlich bis drastisch langsamere Ausbreitungskinetiken und geringere Virustiter oder waren gar nicht mehr nachweisbar infektiös. Eine mögliche Erklärung ist, dass bei der Infektion durch die Virusamplifikation selbst geringe Unterschiede in der Replikationsfähigkeit verstärkt werden. Sequenzanalysen der in vivo generierten Viren zeigten eine hohe genetische Stabilität; nur in zwei Fällen traten Mutationen innerhalb der veränderten De-Sequenz auf.
Das ursprüngliche Modell des oberen De-Stammes als rigidem Abstandshalter zwischen den konservieren bulge- und loop-Elementen kann daher nicht zutreffen; vielmehr zeigen die Ergebnisse, dass die Länge des oberen Stammes in Grenzen modulierbar ist, woraus ein modifiziertes Modell für die Interaktion zwischen P-Protein und DeRNA resultiert. Zum anderen belegen die Daten, dass trotz hoher in vitro Aktivität vieler artifizieller DeRNA-Sequenzen nur die wt-RNA an alle Erfordernisse für eine erfolgreiche Virusvermehrung im immunkompetenten Wirt optimal angepasst ist. Was diese Erfordernisse sind, bleibt zu erforschen. Andererseits geben die Daten dieser Arbeit neue Hinweise darauf, wie durch Veränderung der eRNA-Sequenz von HBV auch für das humane Virus die Rekonstitution enzymatisch aktiver Initiationskomplexe gelingen könnte.


Kurzfassung in Englisch

The hepatitis B virus (HBV) belongs to a family of enveloped hepatotropic DNA viruses. They replicate through reverse transcription of an RNA intermediate, the pregenomic RNA (pgRNA). The interaction between the viral reverse transcriptase (P protein) with a hairpin structure e on the pgRNA plays a crucial role in the replication cycle; e mediates both encapsidation of the pgRNA into the nucleocapsid and the initiation of DNA synthesis via protein-priming. The information for the correct starting point for primer synthesis has to be encoded within the complex made of P protein and eRNA.
For duck HBV (DHBV) priming active complexes can be in vitro reconstituted and ducks can be in vivo infected with DHBV; recombinant viruses are available through transfection of a hepatoma cell line. Therefore, the influence of the DHBVe (De) RNA sequence can be analyzed biochemically for priming activity and genetically for replication competence of mutated viruses in cell culture and in vivo. Previous in vitro experiments showed that the e elements of HBV and DHBV consist of a lower and an upper stem separated through an unpaired bulge region, which contains the template for the primer, and an apical loop. As in both viruses the upper stem is almost completely base paired this base pairing seemed to be of functional importance. New data showed that variants with a mutated sequence and no base pairing in this region were still active in vitro and could support replication. Therefore, the hypothesis for this thesis was that the number of nucleotides rather than sequence and base pairing are important to define the distance between bulge and loop and thus to position the TP domain precisely at the correct starting point on the RNA template. Two classes of DeRNA variants with different length of the upper stem were generated; class I variants were extended or shortened by up to 4 nt, class II variants had an additional deletion of 6 nt on the right side of the upper stem. All De sequence variants were first tested for their in vitro activity, then in the context of full length genomes for replication after transfection and finally for infectivity in primary duck hepatocytes and in vivo in ducklings. Surprisingly, not even the most severe mutations led to a complete loss of activity. Dependent on the test system there were varying differences compared to wt sequence and the other variants. In vitro all the variants of class I except the longest showed higher priming activity than wt RNA; class II variants with additional deletions gave the weakest signals, insertions could partly restore the activity. Using different 32P-labelled dNTPs for primer synthesis it was shown that efficiency but not specificity of primer initiation is affected. After transfection there was not much difference in efficiency of replication; the in vitro most active RNA sequences´ replication activity was only slightly better than wt virus, but even the weakest priming active class II variants produced measurable amounts of progeny DNA. From these data it can be concluded that either wt virus already replicates with highest possible efficacy or that the advantages and disadvantages of individual RNA variants in vitro were compensated by cell factors. In all variants the (-)-strand DNA had the authentic 5´ end; none of the De RNA modifications led to a significant shift of the starting point of the primer. The strongest differences occurred after infection of hepatocytes and in vivo. Only one variant reached almost wt level in infectivity (class I with a deletion of 2 nt on the right side of the upper stem), all the others showed substantially or drastically slower kinetics of infection, lower viral titers, or were not detectably infectious any more. A possible explanation is that even minor changes in replication efficacy are massively potentiated in infection by the strong virus amplification. Sequence analyses of the in vivo generated viruses showed an unexpectedly high genetic stability; only in two cases could mutations in the De sequences be found, one of which may be explained by increased replication efficiency.
The initial model of the upper stem as a rigid spacer between the conserved bulge and loop can therefore not be correct; the data of this thesis show that the distance between bulge and loop can be modulated over a wide range without loss of function. This leads to a modified new model for the interaction between P protein and De RNA. These data also prove that, despite high in vitro activity of many artificial De RNA sequences, only wt RNA is ideally adapted through long co-evolution with the host to meet all requirements for successful virus amplification in the immunocompetent host. The exact nature of these requirements has to still be elucidated; however, these data already give new hints how changes in the eRNA sequence of HBV may be used to reconstitute enzymatically active initiation complexes for the human virus.


SWD-Schlagwörter: Hepatitis-B-Virus , Replikation
Freie Schlagwörter (deutsch): DHBV
Freie Schlagwörter (englisch): Hepatitis B virus , DHBV , encapsidation signal , replication
Institut: Institut für Biologie 2
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Neuhaus, Gunther (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.12.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 21.01.2010
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