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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-72088
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/7208/


Röseler, Sabrina

Funktionsuntersuchungen von Septinen

Studies of septin function

Dokument1.pdf (11.039 KB) (md5sum: bc64e6cfb8252b5922d624ccda91d3eb)

Kurzfassung in Deutsch

Septine wurden ursprünglich in Hefemutanten mit Defekten in der Zytokinese entdeckt. Sie gehören zur Familie der GTPasen und sind bei Eukaryonten ubiquitär verbreitet. Beim Mensch wurden bisher 14 Septine identifiziert. Ihre vielfältigen Funktionen in der Zelle (u.a. Mitose, Zytokinese, Organisation des Zytoskeletts, Apoptose, Vesikeltransport, Exozytose) üben Septine in Form von Heteropolymeren aus. Sie dienen außerdem als Gerüste für Adaptorproteine und wirken als Diffusionsbarrieren. Für einige Septine existieren bereits „Knockout“-Mäuse. Manche ihrer physiologischen Funktionen wie Embryonalentwicklung, Spermatogenese und Regulation der Thrombozytenfunktion sind daher bekannt.

Über die Rollen von Sept8 und Sept11 im Organismus liegen bisher keine Informationen vor. Zur Generierung einer konstitutiven Sept8-„Knockout“-Maus wurde ein „Targeting“-Konstrukt kloniert und in ES-Zellen transfiziert. 488 Neomycin-resistente Klone wurden über Southern Blot auf homologe Rekombination hin überprüft, aber es konnte kein positiver Klon identifiziert werden. Aus diesem Grund wurde ein zweites „Targeting“-Konstrukt kloniert, das im Rahmen dieser Arbeit aber nicht mehr in ES-Zellen transfiziert werden konnte.

Parallel dazu wurde mit der Generierung einer Sept11-„Knockout“-Maus begonnen. Zur Erzeugung von Chimären wurden die beiden rekombinanten ES-Zelllinien XG947 und KST319, in denen der Sept11-Locus über „Gene trapping“ inaktiviert wurde, in Blastozysten injiziert. Diese wurden anschließend in die Uteri von Ammenmäusen implantiert. Aus der Blastozysteninjektion mit XG947 konnte kein chimäres Tier erhalten werden. Mit KST319 konnten vier weibliche und zwei männliche Chimären erzeugt werden. Aus der Verpaarung der Chimären mit C57/Bl6 resultierten vier heterozygote männliche Tiere, von denen eines verstorben ist. Die verbliebenen Tiere werden zurzeit mit C57/Bl6 rückverpaart und haben zum Teil schon wieder heterozygote Nachkommen.

Im zweiten Teil der Arbeit wurden verschiedene Interaktionsstudien mit dem Septin SEPT11 durchgeführt. Durch Screening einer cDNA-Bank aus humanem Herzzellen konnten die schon bekannten Septine SEPT7_v1, SEPT7_v2 und SEPT4_v3 sowie eine noch nicht beschriebene Isoform von SEPT5 als Interaktionspartner von SEPT11 identifiziert werden. SEPT5_v3 entsteht durch Verwendung eines alternativen Exons am 5´-Ende und unterscheidet sich daher am N-Terminus von SEPT5_v1 und SEPT5_v2. Die gefundenen Interaktionen konnten mit „Pull-Down-Assays“ bestätigt werden. Mittels ß-Galactosidase Assay wurde illustriert, dass SEPT4 und SEPT5 stark mit SEPT11 interagieren, SEPT7 hingegen nur relativ schwach. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Interaktion zwischen SEPT5 und SEPT11 bei beiden Proteinen über das G1-Motiv innerhalb der GTP-bindenden Domäne und die C-terminale Extension vermittelt wird.

In HEK293-Zellen bildet SEPT11 vermutlich mit SEPT2 und SEPT7 einen Komplex. Eine Reduktion der SEPT7- bzw. SEPT11-Expression durch Transfektion von siRNA führte zu einer verminderten Expression beider Bindungspartner.

Septine können auch mit anderen Proteinen wechselwirken. So ist bekannt, dass sie z.B. mit Komponenten des Exozyst- und des SNARE-Komplexes interagieren. In dieser Arbeit wurde die Bindung zwischen SEPT11 und dem SNARE-assoziierten Protein Snapin u.a. über Kotransformation und ß-Gal Assay nachgewiesen. Zudem konnte mit rekombinantem SEPT11 Snapin aus HEK293-Lysat präzipitiert werden. Umgekehrt ließen sich mit rekombinantem Snapin SEPT11 sowie SEPT2 und SEPT7 präzipitieren. Ebenfalls über „Pull-Down Assay“ wurde gezeigt, dass Snapin-S50D, eine Mutante, die den phosphorylierten Status imitiert, eine schwächere Bindung gegenüber den Septinen aufweist als WT-Snapin. Abschließend wurde durch immunzytochemische Untersuchungen eine Kolokalisation von Snapin und SEPT11 insbesondere im perinukleären Bereich belegt.

Aufgrund des vermuteten SEPT2/711-Komplexes in HEK293-Zellen wurde geprüft, ob diese Septine auch in ähnlicher Weise mit dem Zytoskelett assoziiert sind. Immunfluoreszenzbilder zeigten, dass alle drei Septine mit Mikrotubuli in Interphase-Zellen und mit dem Spindelapparat in mitotischen Zellen kolokalisieren. Eine Kolokalisation mit Aktinfasern wurde nicht beobachtet. Parallel zu HEK293 wurden HUVEC-Zellen untersucht. Auch hier liegen die drei Septine mit Mikrotubuli assoziiert vor. Im Gegensatz zu HEK293-Zellen sind in HUVEC-Zellen SEPT2 und SEPT7 mit Aktinfasern assoziiert. Eine Assoziation von SEPT11 mit Aktin war wie bei HEK293 nicht erkennbar.


Kurzfassung in Englisch

Septins were originally identified in mutants of Saccharomyces cerevisiae with defects in their cytokinesis. They belong to the family of GTPases and are distributed ubiquitary in eukaryotes. In human beings 14 septins have been identified until today. Septins establish heteropolymers which are required for performing their multiple functions (e.g. mitosis, cytokinesis, organization of the cytoskeleton, apoptosis, vesicle trafficking and exocytosis). Furthermore they serve as scaffolds for adaptor proteins and act as diffusion barriers. Knockout mice are already available for some septins. That way some of their physiological functions like embryonic development, spermatogenesis and regulation of platelet function are known.

There is currently no information available on the role of Sept8 und Sept11 in organisms. To generate a constitutive Sept8 knockout mouse a targeting construct was cloned and subsequently transfected in ES cells. 488 neomycin resistant clones were analysed for homologous recombination by means of Southern Blot, but no positive clone was identified. Therefore a second targeting construct was cloned. Transfection in ES cells was not implemented in this study.

Simultaneously work started to establish a Sept11 knockout mouse. To generate chimera the recombinant ES cell lines XG947 and KST319 comprising a Sept11 locus inactivated via gene trapping were injected into blastocysts. These blastocysts were then implanted into the uteri of foster mice. No chimera could be produced using blastocysts containing XG947. Four female and two male chimera were obtained with blastocysts containing KST319. Mating of the chimera with C57/Bl6 mice resulted in four heterozygous males, one of them already dead. At the moment the remaining animals are being further backcrossed with C57/Bl6 and have heterozygous offspring.

In the second part of this thesis different interaction studies with SEPT11 were performed. Screening of a human heart cDNA library revealed SEPT7_v1, SEPT7_v2, SEPT4_v3 and the new isoform SEPT5_v3 as interaction partners of SEPT11. SEPT5_v3 is generated via usage of an alternative exon at the 5´-end and thus differs from SEPT5_v1 and SEPT5_v2 at the N-terminus. Interactions could be confirmed through the use of pull-down assays. Using a ß-gal assay it was illustrated, that SEPT4 and SEPT5 interact strongly with SEPT11, whereas the interaction between SEPT7 and SEPT11 is weak, compared to the positive control. Further studies showed that the interaction between SEPT5 and SEPT11 is mediated through the G1 motif within the GTP-binding domain and the C-terminal extension.

In HEK293 cells SEPT11 forms a complex with SEPT2 and SEPT7. A reduction of SEPT7 or SEPT11 expression via transfection of siRNA resulted in impaired expression of both binding partners.

Septins can also interact with other proteins e. g. components of the exocyst and the SNARE complex. In this study binding between SEPT11 and the SNARE-associated protein (snapin) was verified using co-transformation and ß-gal assay In addition snapin could be precipitated from HEK293 lysate with recombinant SEPT11. Vice versa SEPT11, SEPT2 and SEPT7 were precipitated with recombinant snapin. Using the pull-down assay it was demonstrated, that snapin-S50D, a mutant which imitates the phosphorylated status, has a lower affinity towards septins compared with wildtype snapin. Finally, a colocalization of snapin und SEPT11, particulary in the perinuclear area, was demonstrated in immuncytochemical studies.

Due to the possible existence of a SEPT2/711 complex in HEK293 cells it was investigated, whether these septins are similary associated with the cytoskeleton. Immunfluorescence pictures showed all three septins colocalizing with microtubules in interphase cells and the mitotic spindle. Colocalisation with actin stress fibers was not observed. Attendant to HEK293 HUVEC cells were examined: all three septins are associated with microtubules. Association with actin was observed for SEPT2 and SEPT7 but not for SEPT11 in HUVEC cells.


SWD-Schlagwörter: Guanosintriphosphatasen , Exocytose
Freie Schlagwörter (deutsch): Septin , Knockout-Maus , Interaktionsstudien
Freie Schlagwörter (englisch): GTPases , exocytosis , septin , knockout mouse , interaction studies
Institut: Univ.-Kinderklinik
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Neuhaus, Gunther (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.12.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 08.02.2010
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