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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-73075
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/7307/


Lehwald, Patrizia

Biokatalytische Synthese tertiärer Alkohole mittels asymmetrischer Carboligationsreaktion unter Verwendung eines Thiamindiphosphat-abhängigen Enzyms

Biocatalytic synthesis of tertiary alcohols via asymmetric carboligation reaction using a thiamine diphosphate-dependent enzyme

Dokument1.pdf (13.531 KB) (md5sum: 1a8bb671caa220fd69e3b133a8d755ef)

Kurzfassung in Deutsch

Der Zugang zu enantiomerenreinen Verbindungen spielt eine wichtige Rolle für die Synthese biologisch aktiver Substanzen. Asymmetrische C-C-Bindungsknüpfungen stellen hierbei eine besondere Herausforderung dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die erste biokatalytische Variante einer asymmetrischen Aldehyd-Keton-Carboligationsreaktion unter Verwendung eines Thiamindiphosphat-abhängigen Enzyms aus Yersinia pseudotuberculosis entwickelt. Auf diese Weise lassen sich enantiomerenangereicherte tertiäre Alkohole aufbauen.

Der Biokatalysator YerE wurde durch Expression in Form eines His-tag Proteins erhalten. Die Untersuchung des Substratspektrums im Hinblick auf Ketone als Akzeptoren führte zur Identifizierung zahlreicher, YerE-katalysierter Transformationen. Mit dem Enzym lassen sich sowohl cyclische Ketone ohne weitere funktionelle Gruppen als auch Ketone mit Ether-, Thioether- oder Esterfunktion, Diketone sowie alpha- und beta-Ketoester umsetzen. Für eine genaue Charakterisierung (NMR, GC-MS, IR, HPLC oder GC an chiraler Phase, Drehwert) wurden die entsprechenden Carboligationsprodukte aus Ansätzen mit 0.8 bis 1.0 mmol Akzeptorsubstrat isoliert.

Bei den untersuchten Reaktionen zeigten sich deutliche Unterschiede in der Stereoselektivität des Proteins. Neben einzelnen enzymatischen Produkten mit einem Enantiomerenüberschuss (ee) von > 90% sowie mehreren Verbindungen mit einem moderaten ee zwischen 60 und 90% werden manche Substanzen auch in nahezu racemischer Form gebildet. Darüber hinaus konnte eine Beeinflussung der enzymatischen Aktivität durch den Zusatz der Nukleotide Cytidindiphosphat (CDP) und Cytidinmonophosphat (CMP) nachgewiesen werden.

Die gekreuzten Aldehyd-Keton-Kupplungsprodukte wurden durch Einsatz des physiologischen Substrats Pyruvat als Acetaldehyd-Synthon erhalten, da es sich bei der alpha-Ketosäure um das beste Donorsubstrat für das Enzym YerE handelt. Darüber hinaus ist es ebenso möglich Acetaldehyd, wenn auch mit geringer Enzymaktivität und Umsatzrate, direkt für die Reaktion einzusetzten. Diese Transformation konnte durch Verwendung von [1-13C]-Cyclohexanon, [2-13C]-Pyruvat sowie nichtmarkiertem Acetaldehyd und nachfolgende 13C-NMR-Spektroskopie nachgewiesen werden.

Neben der Umsetzung aromatischer Aldehyde als Akzeptorsubstrate zu (R)-Phenylacetylcarbinol-Derivaten wurden im Rahmen dieser Arbeit weitere YerE-Aktivitäten gefunden, bei denen es sich um Aktivitäten klassischer ThDP-abhängiger Enzyme handelt. So lassen sich durch YerE-Katalyse auch Acetolactat und Acetoin enantiomerenangereichert gewinnen. Das Protein YerE stellt somit ein wichtiges Bindeglied zu anderen bereits gut untersuchten Enzymen wie der Pyruvatdecarboxylase aus Saccharomyces cerevisiae (ScPDC) oder Zymomonas mobilis (ZmPDC) und den Acetohydroxysäuresynthasen aus Escherichia coli (EcAHAS) dar. Durch den Einsatz des Katalysators YerE lässt sich das Spektrum ThDP-Enzym-vermittelter Reaktionen um eine asymmetrische intermolekulare Aldehyd-Keton-Carboligationsreaktion entscheidend erweitern.


Kurzfassung in Englisch

The access to enantiopure compounds is of great value for the synthesis of biologically active compounds. Herein asymmetric C C-bond formations are a special challenge. Within the present work the first biocatalytic variant of an asymmetric aldehyde-ketone carboligation reaction was developed using a thiamine diphosphate-dependent enzyme from Yersinia pseudotuberculosis. In this manner enantiomerically enriched tertiary alcohols can be prepared.

The biocatalyst YerE was obtained as His-tag protein after recombinant expression. The investigation of the substrate range with regard to ketones as acceptors leads to the identification of various YerE-catalyzed transformations. Cyclic ketones without any further functional groups as well as ketones with an ether-, thioether- or ester moiety, diketones and alpha- and beta-ketoesters are converted by the enzyme. The corresponding carboligation products were isolated from preparations with 0.8-1.0 mmol acceptor substrate for characterization (NMR, GC-MS, IR, HPLC or GC on chiral phase, optical rotation).

The investigated reactions revealed significant differences in the stereoselectivity of the protein. Next to single enzymatic products with an enantiomic excess (ee) of > 90% as well as several compounds with a moderate ee between 60 and 90% some substances are nearly racemic. Moreover, the interference of the enzymatic activity by the addition of the nucleotides cytidine diphosphate (CDP) and cytidine monophosphate (CMP) was demonstrated.

The aldehyde-ketone cross-coupling products were obtained using the physiological substrate pyruvate as the acetaldehyde synthon because the alpha-ketoacid was the best donor substrate for the enzyme YerE. Nevertheless, it is also possible to apply acetaldehyde directly into this reaction even with lower enzymatic activity and conversion rate. This transformation could be demostrated by the application of [1-13C]-cyclohexanone, [2-13C]-pyruvate as well as non-labeled acetaldehyde and subsequent 13C-NMR-spectroscopy.

Within the present work there were identified further YerE-activities next to the conversion of aromatic aldehydes as acceptor substrates to (R)-phenylacetylcarbinol-derivatives. These are activities of classic ThDP-dependent enzymes. Under YerE-catalysis it is also possible to obtain enantiomerically enriched acetolactate and acetoin.
Thus the protein YerE is an important connector to other already good examinated enzymes like the pyruvate decarboxylase from Saccharomyces cerevisiae (ScPDC) or Zymomonas mobilis (ZmPDC) and the acetohydroxy acid synthases from Escherichia coli (EcAHAS). In conclusion the catalyst YerE enlarges the spectra of ThDP-enzyme-mediated reactions by making an asymmetric intermolecular aldehyde-ketone carboligation reaction feasible.


SWD-Schlagwörter: Biokatalyse , Asymmetrische Synthese , Alkohole <tertiär->
Freie Schlagwörter (englisch): biocatalysis , asymmetric synthesis , alcohols <tertiary>
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Müller, Michael (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.02.2010
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 09.03.2010
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