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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-73589
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/7358/


Halter, Claudia Christine

Forensische Bedeutung polarer Ethanolmetaboliten und ihre Detektion mittels LC-MS/MS

Forensic importance of polar ethanol metabolites and their detection by LC-MS/MS

Dokument1.pdf (4.992 KB) (md5sum: 46a5143f25175e850df661affaa59904)

Kurzfassung in Deutsch

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Methodenentwicklung zum Einsatz der Ethanolmetaboliten Ethylglucuronid (EtG), Ethylsulfat (EtS) und Ethylphosphat zum Nachweis von Alkoholkonsum. Außerdem wurden Trinkversuche zur Detektierbarkeit dieser Konjugate durchgeführt, die Aufschluss über Entstehung, Elimination und damit über die Nachweisbarkeitsdauer gaben.
Die präanalytische Stabilität der Marker in Urinproben ist dabei ein Problem in der Praxis, da die meisten Proben nach Entnahme in ein Labor eingesandt werden müssen bzw. mikrobieller Befall bei Verstorbenen eine große Rolle spielt. Anhand von Bakterienisolaten aus Leichen wurde die Stabilität von EtG und EtS gegen bakterielle Zersetzung geprüft. E. coli und C. sordellii bauten EtG ab und zeigten auch in vitro Glucuronidaseaktivität, der untersuchte K. pneumoniae-Stamm baute EtG nicht ab. EtS war gegen alle drei untersuchten Bakterienstämme stabil. Die Stabilität von EtS wurde zusätzlich im Rahmen standardisierter OECD-Abbautests untersucht. Im Closed Bottle Test mit geringer Nährstoff- und Bakteriendichte konnten die Bakterien aus einem Kläranlagenablauf EtS innerhalb von 28 Tagen nicht abbauen. Im Manometric Respiratory Test mit höherer Dichte war EtS für sechs Tage stabil, wurde jedoch innerhalb von 28 Tagen komplett abgebaut, so dass auch für EtS prinzipiell ein mikrobieller Abbau in Betracht kommt. Zur Verhinderung des bakteriellen Abbaus von Ethylglucuronid wurden verschiedene Konservierungsmittel über einen achttägigen Zeitraum getestet. Diese Untersuchungen ergaben, dass z.B. kommerziell erhältliche borsäurehaltige Urinentnahmeröhrchen für die Stabilisierung von Urinproben und eine LC-MS/MS Analyse geeignet sind.
Zur genaueren Untersuchung der Entstehung und Elimination von EtG und EtS wurden Trinkversuche mit unterschiedlichen Trinkmengen durchgeführt. Versuche mit kleinen Trinkmengen sollten dabei „versteckte“ Alkoholika simulieren, und es sollte überprüft werden, ob und wie lange geringe Mengen zu einer Nachweisbarkeit von EtG bzw. EtS führen. Dabei ergab sich dass ab 1 g Ethanol bereits EtG und EtS oberhalb der Cut-offs von 0,1 mg/L nachweisbar sind. Eine Normierung auf Kreatinin (100 mg/dL) erscheint dabei in den meisten Fällen sinnvoll zu sein, da es die Urinverdünnung durch Flüssigkeitsaufnahme kompensiert. Eine Anpassung von Grenzwerten ist – basierend auf den Anforderungen an den Probanden und dem Aufklärungsgrad über versteckte Alkoholika – sinnvoll.
Nach oraler Aufnahme von Hefe und Zucker konnten ebenfalls EtG und EtS deutlich oberhalb des Cut-offs in Urin nachgewiesen werden.
Zur weiteren Absenkung der Matrixbelastung und der Nachweisgrenze, z.B. für Forschungszwecke, wurde eine Festphasenextraktionsmethode für EtG entwickelt, die jedoch im Vergleich zur Routinemethode einen erhöhten Arbeitsaufwand erfordert.
Auf Basis eines Trinkversuchs, bei dem die Blutalkoholkonzentration von 0,5 – 0,8 ‰ erreicht werden sollte, wurde ein publiziertes Kinetikmodell, welches für EtG erstellt wurde, für EtS angewandt. Dadurch wurde eine Möglichkeit geschaffen, unter Einbeziehung von interindividuell unterschiedlichen Entstehungs- und Eliminationskonstanten anhand von EtS-Konzentrationen im Serum auf eine Mindest- und Maximaltrinkmenge zurückzuschließen, wenn entsprechende Zeitangaben vorliegen.
Ein weiterer Punkt war die Aufklärung falschpositiver EtG-Nachweise - entstanden durch endogene oder exogene, im LC-MS/MS bei unzureichender Trennung in der Chromatographie interferierende Komponenten - die durch Optimierung der Chromatographie und Beachtung von Fragmentionenverhältnissen vermieden werden konnten.


Kurzfassung in Englisch

The present thesis describes LC-MS/MS method development for the use of ethanol metabolites ethyl glucuronide (EtG), ethyl sulfate (EtS) and ethyl phosphate as alcohol consumption markers. Drinking experiments were performed for detection of these conjugates, which gave information on formation, elimination and therefore the period of detection.
Preanalytical stability of urinary markers is a problem in practical domain, as most specimens have to be shipped to a laboratory after sampling, or are of post-mortem origin where bacterial colonisation is of major importance. With bacteria isolated from dead bodies, stability of EtG and EtS against bacterial decomposition was assessed. E. coli and C. sordellii decomposed EtG and showed in vitro glucuronidase activity, the chosen K. pneumoniae strain did not decompose EtG. EtS was stable with all three strains of bacteria. Additionally, EtS stability was checked with standardised OECD decomposition tests with bacteria from the effluent of a wastewater treatment plant. In Closed Bottle Test with low density of nutrients and bacteria, EtS was not degraded within 28 days. In Manometric Respiratory Test with higher density, EtS was stable for 6 days, but was completely decomposed within 28 days. Therefore, also for EtS, bacterial degradation generally is possible.
To prevent the bacterial decomposition of EtG, several preservatives were checked for a period of 8 days. As a result, commercially available sampling tubes with boric acid are suitable for stabilisation of urine samples and subsequent LC-MS/MS analysis.
For more detailed assessment of formation and elimination of EtG and EtS, drinking experiments with different amounts of ethanol were performed. Samples containing small amounts of ethanol were utilised to simulate “hidden” alcohol and to assess the detection windows for EtG and EtS after consumption of minor amounts of ethanol. Beginning from 1 g ethanol, EtG and EtS were detectable above the cut-off of 0.1 mg/L. Creatinine normalisation (100 mg/dL) appeared useful in most cases, as it compensates for urine dilution
Depending on the requirements concerning the proband and his state of information about hidden alcohol, adaptation of cut-off values is advisable. After oral consumption of yeast and sugar, urinary EtG and EtS were detectable well above the cut-off concentration.
For further reduction of matrix effects and LOQ, e.g. for research purposes, a solid phase extraction method was developed, but compared to the routine method, the SPE requires a higher work load.
Based on a drinking experiment with an intended blood ethanol concentration of 0.05 - 0.08 %, a kinetic model designed for EtG was applied to EtS.
By inclusion of inter-individually differing formation and elimination constants, a possibility was created to calculate minimal and maximal drinking amounts from EtS concentrations in serum, provided that adequate time specifications were available.
Another topic was the elucidation of false positive EtG analysis. These resulted from endogenous or exogenous compounds, interfering in the LC-MS/MS after insufficient chromatographic separation and could be avoided by chromatographic optimisation and consideration of fragment ion ratios.


SWD-Schlagwörter: Alkoholkonsum , Biomarker , Toxikologie , Gerichtliche Toxikologie , LC-MS
Freie Schlagwörter (deutsch): Ethylglucuronid , Ethylsulfat , Ethylphosphat , Alkoholkonsummarker , Abstinenz
Freie Schlagwörter (englisch): ethyl glucuronide , ethyl sulfate , ethyl phosphate , alcohol consumption marker , abstinence
Institut 1: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Institut 2: Inst. für Rechtsmedizin
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Jung, Manfred (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.12.2009
Erstellungsjahr: 2009
Publikationsdatum: 30.03.2010
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