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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-75829
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/7582/


Bienert, Roland

Protonentransportgetriebene Konformationsänderungen in einzelnen H+-ATPsynthasen aus Chloroplasten sowie Kombination einer optischen Falle mit konfokaler Fluoreszenzspektroskopie

Subunit movements in single H+-ATPsynthases from Chloroplasts during ATP synthesis and combination of optical tweezers with confocal fluorescence spectroscopy

Dokument1.pdf (15.068 KB) (md5sum: befac96a04c5391ce0184fef0e196091)

Kurzfassung in Deutsch

H+-ATPsynthasen spielen bei der Energieversorgung aller Zellen eine zentrale Rolle. Sie koppeln den transmembranen Protonentransport mit der Synthese von ATP aus ADP und Phosphat. Dabei zeigen diese Enzyme einen einzigartigen Mechanismus, bei dem ein Teilkomplex des Enzyms (Rotor) relativ zu den anderen Untereinheiten (Stator) rotiert. Diese Rotation wurde intensiv an bakteriellen Enzymen untersucht. Für eukaryotische H+-ATPsynthasen konnte die Rotation bei der ATP Synthese erstmalig in dieser Arbeit an dem Enzym aus Chloroplasten (CF0F1) nachgewiesen werden. Dafür wurde der Rotor mit einem Donorfluorophor (ATTO532) kovalent an der Position gamma-C322 markiert. Auf dem ersten nicht katalytischen Bindungsplatz (Stator) wurde ein mit einem Akzeptorfluorophor markiertes Nukleotid (ATTO655-AMPPNP) nichtkovalent gebunden. Die doppelt markierten Enzyme wurden in Liposomen rekonstituiert und single pair Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (spFRET) Messungen von frei diffundierenden Proteoliposomen in einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop durchgeführt. Diese Methode erlaubt es aus der zeitaufgelösten Effizienz des Energietransfers vom Donor auf den Akzeptor intramolekulare Abstandsänderungen in einzelnen Enzymen bei der Katalyse zu verfolgen. Unter nicht-katalytischen Bedingungen wurden Photonenbursts erhalten, die eine konstante und sehr hohe Transfereffizienz (H*AMPPNP) zeigen. Dies entspricht einem niedrigen, während der Beobachtungszeit konstantem Fluorophorabstand, der die Konformation inaktiver Enzyme repräsentiert. Bei Messungen bei der ATP Synthese wurden hingegen Bursts detektiert, die stufenförmige Änderungen in der Transfereffizienz zeigen. Die FRET-Zustände konnten in drei Populationen L (low), M (medium) und H (high) eingeteilt werden. Die Sequenz der Transfereffizienzänderungen innerhalb eines Bursts folgte dabei dem repetitiven Muster L - M - H - …. Die aus den mittleren Transfereffizienzen berechneten Fluorophorabstände wurden mit Abständen aus einem Homologiemodell verglichen, bei welchem die gamma-Untereinheit in drei Schritten um je 120° rotiert wurde. Aus der Übereinstimung der Abstände wurde geschlossen, dass die gamma-Untereinheit in CF0F1 während der ATP Synthese in 120°-Schritten rotiert. Neben Bursts mit stufenförmigen Änderungen wurden auch Bursts mit konstanter Transfereffizienz beobachtet. Dabei wurden ebenfalls die drei Populationen L, M und H sowie eine vierte Population (H*ADP) erhalten, welche der H*AMPPNP Population der inaktiven Enzyme sehr ähnelt und somit vermutlich ebenfalls eine Konformation von inaktiven Enzymen anzeigt. Die Populationen L, M, und H entsprechen Konformationen aktiver Enzyme. Die gelegentliche Detektion von Aktivierungs- und Deaktivierungsschritten an einzelnen Enzymen wurde an prokaryotischen Enzymen bislang noch nicht beobachtet, was auf eine regulatorische Besonderheit der H+-ATPsynthasen höherer Organismen hindeutet, die mit größeren Konformationsänderungen einhergeht.
Die wesentliche Limitierung der hier verwendeten Methode ist das Herausdiffundieren der Proteoliposomen aus dem konfokalen Detektionsvolumen. Dies begrenzt die Beobachtungszeit, was sich besonders in der geringen Zahl der beobachteten Deaktivierungsschritte widerspiegelt. Dieses Problem kann auf elegante Weise durch die Verwendung einer optischen Falle gelöst werden, wodurch die Proteoliposomen im Zentrum des konfokalen Detektionsvolumens fixiert werden können. Dazu wurde im zweiten Teil dieser Arbeit eine apparative Neuerung eingeführt, die erstmalig die Möglichkeit eröffnen soll spFRET Messungen an einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop mit einer optischen Falle durch eine „trifokale Anordnung“ zu kombinieren. Das konfokale Fluoreszenzmikroskop wurde dazu mit den Komponenten einer optischen Falle und eines Lichtmikroskops erweitert. Fluoreszenzmarkierte Liposomen konnten mit Hilfe der optischen Falle im Zentrum des konfokalen Detektionsvolumens fixiert werden, wodurch die Beobachtungszeit, verglichen mit frei diffundierenden Proteoliposomen, verdoppelt wurde. Die Beobachtungsdauer der fluoreszenzmarkierten Liposomen nach dem Einfangen hängt nur noch von der Photostabilität der verwendeten Fluorophore ab. Eine Erhöhung der Fluorophorlebensdauer von TMR und ATTO532 wurde apparativ durch die Verwendung einer phasenverschobenen Modulation des Anregungs- und Trappinglasers sowie chemisch durch den Einsatz des ROX-Systems als Triplettlöscher erhalten.
Die schnelle Entvölkerung des Triplettzustands durch das ROX-System in sauerstofffreier Lösung konnte für die Fluorophore TMR und ATTO532 mit Hilfe von FCS-Messungen gezeigt werden. Dadurch konnten zusätzliche Erkenntnisse über den Mechanismus des Fluorophorbleichens bei der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie gewonnen werden.


Kurzfassung in Englisch

H+-ATPsynthases are important enzyme complexes of the energy metabolism in all living cells. They couple a transmembrane proton transport with the synthesis of ATP from ADP and phosphate. This is accomplished by a unique mechanism in which one subcomplex (rotor) performs a rotational movement relative to a second subcomplex (stator). Those inter-subunit movements have been studied intensively with bacterial enzymes. In this work the H+-ATPsynthase from Chloroplasts (CF0F1) was used to show for the first time inter-subunit rotation within eucaryotic enzymes during ATP synthesis in single pair fluorescence resonance energy transfer (spFRET) experiments. Therefore, the rotor subcomplex was covalently labeled with a fluorescence donor (ATTO532) at position C322 of the gamma-subunit. AMPPNP labeled with a fluorescence acceptor (ATTO655) was bound to a non-catalytic binding site at the alpha-subunit. The double labeled enzymes were reconstituted into liposomes and spFRET measurements were performed at free diffusing proteoliposomes in a confocal microscope. This method allows the determination of changes in inter-subunit distances in single enzymes during catalysis from the time resolved fluorescence intensities of the donor and the acceptor. Without catalysis photon bursts obtained from proteoliposomes traversing the confocal detection volume show a constant and very high FRET efficiency (H*AMPPNP). This equates to a low and constant distance between the two labeled sites and represents the conformation of inactive enzymes. However, photon bursts obtained during ATP synthesis show stepwise changes between three distinct populations of FRET efficiency, namely L (low), M (medium) and H (high). Within a single burst the changes in FRET efficiency show the characteristic and repetitive sequence L - M - H -.... The average distances calculated for each FRET population were compared to distances obtained from a homology model of CF0F1 in which the γ-subunit was rotated in three 120° steps. The accordance of measurement and model lead to the conclusion that the gamma-subunit rotates in 120° steps during ATP synthesis. Beside bursts with stepwise changes also bursts with a constant FRET efficiency were obtained, which also could be assigned to the three FRET populations L, M and H. Additionally, a forth population (H*ADP) was found, which is characterised by a very high FRET efficiency similar to H*AMPPNP. Therefore, H*ADP may represent an inactive conformation of the enzyme. The populations L, M and H represent most likely conformations of active enzymes. The occasional observation of activation and inactivation steps may be ascribed to a regulatory peculiarity of the chloroplast enzyme and were so far not observed in procaryotic enzymes.
The major limitation of the method used above is the restricted observation time due to diffusion of the proteoliposomes out of the confocal detection volume. In order to overcome this problem an optical tweezer can be used to trap the proteoliposome in the centre of the detection volume. Therefore, the second part of this work was devoted to the development of a new trifocal setup design by combining confocal microscopy with an optical tweezer. This improvement is supposed to grant access to a broader time frame for spFRET measurements in solution. Hence, the components of an optical tweezer as well as a light microscope were integrated into the confocal microscope. Fluorescence labeled proteoliposomes were trapped in the centre of the confocal detection volume, what doubled the observation time compared to free diffusion. The observation time of trapped liposomes is now restricted by the photostability of the fluorophore.
For the fluorophores ATTO532 and tetramethylrhodamine (TMR) an enhancement of photostability was achieved in two ways. First, the laser power of both trapping and excitation laser were modulated with phase-shifted boxcar functions, which eliminated additional photobleaching pathways due to the presence of the trapping laser. Second, in a chemical approach oxygen was substituted by a reducing and oxidizing system (ROXS) as a triplet quencher. The fast quenching of triplet states in the presence of ROXS was shown for TMR and ATTO532 by FCS studies, which additionally provided a deeper insight into bleaching mechanisms of fluorophores in confocal microscopy.


SWD-Schlagwörter: Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer , Konformationsänderung , Chloroplast , Katalyse , Konfokale Mikroskopie , Wasserstoff-ATP-Synthase
Freie Schlagwörter (deutsch): optische Falle , Proteoliposomen , Setup design , Einzelmolekül
Freie Schlagwörter (englisch): optical tweezer , proteoliposome , setup design , single molecule
Institut: Institut für Physikalische Chemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Gräber, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.04.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 23.06.2010
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