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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-76289
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/7628/


Petzke, Lutz-Henning

Transgenese in Streptomyceten: Transposons, Rekombinasen und Meganukleasen

Transgenesis in streptomycetes: transposons, recombinases and meganucleases

Dokument1.pdf (2.229 KB) (md5sum: 271401f9bbc4f08eedec7717a830720e)

Kurzfassung in Deutsch

Aktinomyceten produzieren eine Vielzahl von bioaktiven Molekülen. Obwohl immer mehr Genome vollständig sequenziert werden, gibt es nur ungenügende Informationen über Proteinfunktionen. Daher ist es notwendig, molekularbiologische Werkzeuge zur Verfügung zu haben, mit denen man gezielte und ungezielte Manipulationen an einem Genom eines Aktinomyceten Genom kann. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Etablierung der Tn5 basierten Transposonmutagenese und der Anwendung der Himar1 basierten Transposonmutagenese. Darüber hinaus wurden die Flp- und Cre-Rekombinase sowie die I SceI Meganuklease angewendet. Alle Systeme basieren auf artifiziellen Genen, die an den Codongebrauch von Streptomyceten angepasst wurden. Damit konnten erstmals verschiedene molekularbiologische Werkzeuge für Streptomyceten zugängig gemacht werden.

Zwei Transposons, Himar1 und eine hyperaktive Mutante des Tn5, konnten erfolgreich verwendet werden, um Mutantenbibliotheken von verschiedenen Streptomyceten zu erzeugen. Die Transposition kann induziert werden und erfolgt in vivo. Aufgrund des R6Kγ Replikationsursprungs ist ein einfaches Identifizieren der Insertionsloci mittels Rettungsplasmidsequenzierung möglich. Die Transpositionen beider Systeme erfolgen ausreichend zufällig. Durchschnittlich wurden Transpositionseffizienzen von > 98 % ermittelt. Mit beiden Transposonsystemen konnten Regulatoren identifiziert werden, die in die Produktion des Sekundärmetabolits Actinorhodin involviert sind.
Das Funktionieren einer künstlichen Flp-Rekombinase konnte für S. lividans TK24 gezeigt werden. Der Nachweis erfolgte anhand des Ausschneidens eines Resistenzgens, das von frt-Sequenzen flankiert wurde, mit der künstlichen Flp-Rekombinase.
Es konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, loxP*-Sequenzen an einer beliebigen Stelle des Genoms von S. aureofaciens Tü117 zu integrieren. Die Integration der loxP*-Sequenzen erfolgte mit einem Plasmid mittels eines Single-Crossovers. Das Ausschneiden des Plasmids konnte mit der Expression des künstlichen Cre-Rekombinasegens erreicht werden. Die I-SceI Endonuklease wurde verwendet, um Reparaturmechanismen von Doppelstrangbrüchen im Genom von S. aureofaciens Tü117 zu untersuchen. Hierfür wurden mittels Single-Crossover ein Plasmid und ein BAC-Vektor, die jeweils eine I SceI-Erkennungssequenz besitzen, in das Genom von S. aureofaciens Tü117 integriert. Das künstliche I-SceI Endonukleasegen wurde in diesem Stamm exprimiert und die Anzahl der Exkonjuganden berechnet. Dadurch lassen sich Reparaturmechanismen wie die homologe Rekombination untersuchen.


Kurzfassung in Englisch

Actinomycetes produce a vast number of bioactive molecules. Though sequenced genomes are evermore commonly available, only little is still known about their associated protein functions. Gaining insights into gene functions and their interdependencies can be greatly enhanced by use of molecular tools for targeted and random mutagenesis. The presented work deals with the establishment and application of Tn5 and Himar1-based transposon mutagenesis systems in addition to Cre-recombinase and I-SceI meganuclease systems. All of these presented systems are based on artificial genes adapted to Streptomycetes codon usage. The use of synthetic genes enabled different molecular tools to be used in Streptomycetes for the first time.
Two transposons, Himar1 and a hyperactive mutant of Tn5, could successfully be used to generate mutant libraries of different Streptomyces strains by in vivo transposition. The R6Kγ origin of replication included in each transposon made it possible to identify insertion loci via rescue cloning. Transposition of both systems was random. On average, transposition frequencies of > 98 % were achieved. With the help of these transposon systems, regulatory genes involved in secondary metabolite production could be identified.
Moreover, a synthetic Flp-recombinase was shown to be functional in S. lividans TK24. Verification was carried out by excision of a resistance gene flanked by frt-sites with the artificial Flp-recombinase.
It was additionally possible to include a loxP*-site at any position of the genome of S. aureofaciens Tü117 via plasmid-mediated single crossover. Excision of the plasmid was achieved by expressing the artificial Cre-recombinase gene.
The I-SceI endonuclease was used to study reparing mechanism of double strand breaks in the genome of S. aureofaciens Tü117. In doing so, a plasmid and a BAC-vector each carrying one I SceI-site were integrated into the genome of S. aureofaciens Tü117 via single crossover. The artificial I-SceI endonuclease gene was expressed in this strain demonstrating that it is possible to study repair mechanisms like homologous recombination.


SWD-Schlagwörter: Streptomycetaceae , Transposon , Rekombination , Mutagenese
Freie Schlagwörter (deutsch): Aktinomyceten
Freie Schlagwörter (englisch): actinomycetes, streptomycetes, transposons, recombination, mutagenesis
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Bechthold, Andreas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 12.05.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 20.07.2010
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