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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-76813
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/7681/


Günther, Andreas

Molekularbiologische Untersuchungen zur Avilamycin-Biosynthese und Isolierung Avilamycin resistenter Aktinomyceten

Biomolecular research on the Avilamycin biosynthesis and isolation of Avilamycin resistant Aktinomycetes

Dokument1.pdf (3.034 KB) (md5sum: 27d886f2045116488f71403736a4c2f5)

Kurzfassung in Deutsch

Avilamycine sind Oligosaccharid-Antibiotika, die von Streptomyces viridochromogenes Tü57 produziert werden. Sie bestehen aus einem terminalen Dichlorisoeverninsäurerest, der esterglykosidisch mit einer Heptasaccharidkette verknüpft ist. Die Avilamycine zeigen sowohl in vitro als auch in vivo herausragende antibakterielle Aktivität gegen viele Gram-positive Bakterien, inklusive Methicillin-resistente Staphylococcus aureus Stämme und Vancomycin-resistente Enterokokken. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden folgende Arbeiten durchgeführt:

•Für die Untersuchungen der Desoxyzuckerbiosynthese des Avilamycins konnten in vitro die Gene aviQ1, aviQ2, aviQ3, aviD, aviE1, aviE2, aviZ1 und aviZ3 erfolgreich in E. coli KRX heterolog exprimiert und aufgereinigt werden. Das Protein AviD konnte in vitro als Nukleotidyltransferase identifiziert werden, das die Aktivierung eines Zucker-phosphates zum Nukleotidzucker katalysiert. Dabei wies AviD eine beträchtliche Substratflexibilität auf, indem es sowohl Uridintriphosphat als auch Des-oxythymidintriphosphat auf Glucose-1-phosphat übertragen kann. In enzymatischen Assays zeigte AviE1 dTDP-D-Glucose-4,6-Dehydratase-Aktivität. Das resultierende Produkt, dTDP-4-Keto-6-desoxy-D-Glucose stellt das zentrale Intermediat für alle Desoxyzucker dar. Durch in vitro Experimente mit AviQ1 konnte gezeigt werden, dass es sich hierbei um eine C-4-Epimerase handelt, die sowohl Hexosen (UDP-Glucose) wie auch Pentosen (UDP-Xylose) als Substrat umzusetzen vermag. Durch Transkriptionsanalysen der betreffenden Gene konnte gezeigt werden, dass diese während der Avilamycinbiosynthese exprimiert werden.

•Die Optimierung der Wachstums- und Produktionsbedingungen führte zu einer deutlich gesteigerten Avilamycinproduktion. Durch die verbesserten Anzuchtbeding-ungen ist eine effizientere Aufreinigung der Avilamycine möglich.

•Die Verwendung von Avilamycin als Selektionsmarker zum verbesserten Screening von Aktinomyceten führte zur Isolierung zahlreicher Bakterienstämme der Ordnung Actinomycetales. Dabei konnte ein Stamm kultiviert werden, der eine antibiotische Substanz produziert, welche den identischen Angriffspunkt wie Avilamycin besitzt, jedoch nicht identisch damit ist.


Kurzfassung in Englisch

Avilamycins are oligosaccharid-antibiotics, produced by Streptomyces viridochromogenes Tü57. They consist of a terminal dichloroisoeverninic acid moiety, that is attached to a hepta-saccharide chain via an esterglycosidic bondage. Avilamycins show in vitro and in vivo excellent antibacterial activity against many Gram-positive bacteria, including methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains and vancomycin-resistant enterococci. Within the scope of this work the following tasks were carried out:

•To investigate the deoxysugar biosynthesis, the following genes aviQ1, aviQ2, aviQ3, aviD, aviE1, aviE2, aviZ1 and aviZ3 were sucsessfully expressed using E. coli KRX and subsequently purified. Protein AviD was in vitro identified as a nucleotidyltransferase, which catalyzes the activation of a sugar-phosphate to the corresponding nucleotide sugar. Thereby AviD exhibited a remarkable substrate flexibility, accepting uridinetriphosphat and desoxythymidinetriphosphat as well as substrates and transferring both to glucose-1-phosphate. In enzymatic assays AviE1 showed dTDP-D-glucose-4,6-dehydratase activity. The resulting product, dTDP-4-keto-6-desoxy-D-glucose is the pivotal intermediate for all deoxysugars. Through in vitro assays with AviQ1 it could be shown, that this enzyme is a C-4-epimerase, accepting both hexoses (UDP-glucose) and pentoses (UDP-xylose) as substrates. Through transcription analysis of the corresponding genes it was shown that all of them were expressed during the avilamycin biosynthesis phase.

•Optimization of the growth and production conditions lead to a drastic improved avilamycin production. Due to enhanced cultivation conditions a more efficient purification of avilamycin is possible.

•The use of Avilamycin as selection marker for the improved screening of actinomycetes lead to the isolation of numerous bacterial strains of the order Actinomycetales. Thereby a strain could be cultivated, which produced an antibiotic compound, which possesses the same mode of action as Avilamycin.


SWD-Schlagwörter: Streptomycetaceae , Antibiotikum , Biotechnologie
Freie Schlagwörter (deutsch): Aktinomyceten , Avilamycin , Antibiotika
Freie Schlagwörter (englisch): Actinomycetes , Avilamycin , antibiotics
CCS Klassifikation Chemie
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Bechthold, Andreas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 31.05.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 14.09.2010
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