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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-77078
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/7707/


Schmid, Bernadette

In vivo Infektiosität und Evolution von Enten-Hepatitis-B-Viren mit artifiziell verändertem RNA-Verpackungssignal Epsilon

In vivo infectivity and evolution of Duck-Hepatitis-B-Viruses with artificially modified RNA encapsidation signal Epsilon

Dokument1.pdf (16.236 KB) (md5sum: c708c674bf440059dd0cfd45b1c5ab6a)

Kurzfassung in Deutsch

Das Hepatitis B-Virus (HBV), eines der wichtigsten viralen Humanpathogene, ist der prototypische Vertreter der Hepadnaviridae, einer Familie kleiner, umhüllter hepatotroper DNA-Viren, die in Säuger-infizierende Orthohepadnaviren und Vögel-infizierende Avihepadnaviren unterteilt wird. Die Replikation aller Hepadnaviren verläuft über die reverse Transkription eines RNA-Intermediates, der prägenomischen RNA (pgRNA), die auch als mRNA für die virale Polymerase (P-Protein) und das Coreprotein dient. Eine zentrale Rolle im Replikationszyklus spielt die Wechselwirkung des ε-RNA-Elementes auf der pgRNA mit der Polymerase; sie vermittelt die Verpackung der pgRNA in das Nukleokapsid und die Initiation der (-)-Strang-DNA-Synthese über einen Protein-Priming-Mechanismus. Unter Benutzung einer spezifischen Teilsequenz von ε als Matrize wird dabei ein kurzes DNA Oligonukleotid synthetisiert, dessen 5´ terminales Nukleotid kovalent mit einem Tyrosin-Rest der Terminalen Protein-Domäne (TP) der Polymerase verknüpft ist. Die Information für die Wahl der richtigen Startstelle für die Primersynthese muss also allein in der Konformation des ε:Polymerase-Komplexes enthalten sein. Über dessen Struktur gibt es aber keine direkten Daten. Aufgrund der kompakten Organisation des äußerst kleinen Hepadnavirus-Genoms kommen der ε-Sequenz multiple zusätzliche Funktionen zu; sie ist auch Teil eines offenen Leserasters und überlappt mit regulatorischen cis-Elementen. Für das humane Virus sind die experimentellen Untersuchungsmöglichkeiten äußerst eingeschränkt. Dagegen erlaubt das Enten-HBV (duck hepatitis B virus, DHBV) als Modell die Untersuchung der ε-Funktionen auf allen Ebenen, von der in vitro Charakterisierung der Interaktion mit der Polymerase ("in vitro Priming") bis hin zum komplexen Zusammenwirken aller Funktionen während der in vivo Infektion im authentischen Wirt.
Die für alle weiteren Replikationsschritte unabdingbare Interaktion der ε-RNA mit der Polymerase wird durch die Ausbildung einer in allen Hepadnaviren konservierten, etwa 60 Nukleotide umfassenden Haarnadelstruktur vermittelt. Sie besteht aus einem unteren Stamm, dem Bulge, welcher als Matrize für die Primersynthese dient, dem oberen Stamm und dem apikalen Loop. Der Bulge und laut bisheriger Daten auch der Loop sind wichtig für die spezifische Bindung der Polymerase; dagegen ist wenig bekannt über die Rolle des beide Elemente verbindenden oberen Stammes. In allen Orthohepadnaviren und in DHBV ist diese Region fast vollständig basengepaart und damit strukturell rigide, in vielen anderen Avihepadnaviren dagegen nicht. Es ist daher unklar, ob der obere Stamm per Sequenz oder Struktur zur exakten Positionierung der Polymerase über der korrekten Startstelle auf der RNA Matrize aktiv beiträgt, oder nur Bulge und Loop als die eigentlich wichtigen Elemente passiv miteinander verbindet. In diesem Fall könnte die spezifische Sequenz des oberen Stammes für andere Funktionen von Bedeutung sein.
Zur experimentellen Überprüfung dieser Alternativen wurden Expressionsvektoren für variante Viren generiert, die sich in ihren ε-Sequenzen z.T. massiv von der Wildtyp-DHBV Sequenz unterscheiden. Grundlage waren zuvor auf in vitro Bindung an Polymerase selektionierte Sequenzen, die – ebenfalls in vitro – sehr unterschiedliche Priming-Aktivitäten gezeigt hatten. Mittels Transfektion in die Hühnerhepatom-Zelllinie LMH wurde zunächst die grundsätzliche Replikationsfähigkeit überprüft, dann, soweit möglich, Virionen aus den Zellkulturüberständen gewonnen und für Infektionsversuche mit primären Entenhepatozyten, schließlich auch in Enten eingesetzt. Alle Viren mit Sequenzen, die eine gut nachweisbare in vitro Aktivität gezeigt hatten, waren Replikations-kompetent und auch in der Lage, eine in vivo Infektion zu etablieren; Unterschiede zum Wildtyp-DHBV in Ausbreitungskinetik und maximal erreichten Virustiter traten jedoch viel deutlicher zutage als in den transfizierten LMH-Zellen. Durch die grundsätzlich vorhandene in vivo Infektiosität der meisten Varianten wurde es möglich, mittels mehrfacher in vivo Passagierung auf die potentielle Evolution neuer Virusvarianten mit erhöhter Fitness zu testen. Insgesamt wurde dabei eine unerwartet hohe genetische Stabilität beobachtet, trotzdem konnte für ein variantes Virus die Fixierung mehrerer neuer Mutationen innerhalb der veränderten ε-Sequenz nachgewiesen werden; Koinokulationsexperimente mit der ursprünglichen Variante belegten, dass tatsächlich eine Selektion auf höhere Fitness stattgefunden hatte. Diese korrelierte zumindest zum Teil auch mit einer höheren in vitro Priming Aktivität der entsprechenden ε-Sequenzen. In direkter Konkurrenz mit dem Wildtyp-Virus konnte sich jedoch keine der ursprünglichen und nur eine der neuen Varianten (bei hohem Überschuss im Inokulum) durchsetzen, trotz teilweise Wildtyp-ähnlicher in vitro Aktivität, Replikationskompetenz und sogar ähnlicher Effizienz bei der Monoinfektion in vivo.
Generell belegen diese Daten, dass die authentische ε-Sequenz, optimiert durch langwährende Koevolution mit dem Wirt, dem Wildtyp-Virus in vivo Vorteile verschafft, die sich z.T. weder in vitro noch bei der Monoinfektion in vivo manifestieren. Die Aufklärung der zugrundeliegenden Mechanismen wird durch vielfältigen Möglichkeiten, inklusive der Rolle des Wirtsimmunsystems, erschwert. Andererseits ermöglicht die in mehreren Fällen klare Korrelation zwischen in vivo Fitness und in vitro Priming- und Replikationsfähigkeit dennoch Rückschlüsse auf die für das Virus fundamentale Interaktion zwischen ε und Polymerase. Zum einen konnten bislang ausschließlich auf in vitro Versuchen beruhende Vorstellungen zur Rolle individueller Nukleotide im oberen Stamm in vivo verifiziert werden. Zum anderen ergaben die in vivo evolvierten Varianten neue Erkenntnisse zur Funktion des apikalen Loops. Darüberhinaus gelang es mit einem in vivo Selektionsverfahren, die wichtigsten Nukleotid-Positionen in diesem Subelement wesentlich schneller zu definieren als durch in vivo Evolution möglich; innerhalb weniger Wochen setzte sich hier eine einzige, an 5 von 7 Positionen mit der Wildtyp-Sequenz identische Variante durch. Dieses Verfahren bietet sich daher als Methode der Wahl für die zukünftige weitergehende Charakterisierung der ε:Polymerase-Interaktion an.


Kurzfassung in Englisch

Hepatitis B Virus (HBV), one of the most important human viral pathogens, belongs to a family of small enveloped hepatotropic DNA viruses termed Hepadnaviridae. The virus family is divided into the genera of mammal-infecting Orthohepadnaviruses and bird-infecting Avihepadnaviruses. Both replicate by reverse transcription of an RNA-intermediate, the pregenomic RNA (pgRNA), which also serves as the mRNA for the viral polymerase (P-protein) and the core protein. The interaction between the polymerase and a hairpin structure on the pgRNA, ε, plays a critical role in the replication cycle, inducing both encapsidation of the pgRNA into the nucleocapsid and initiation of DNA (-)-strand-synthesis via a protein-priming mechanism. Using a specific subsequence of Dε as a template a short DNA oligonucleotide is synthesised, the 5´-end of which is covalently attached to a tyrosine residue of the polmerase´s terminal protein (TP) domain. Thus the information for the correct starting point for primer synthesis has to be encoded within the complex of P-protein and ε-RNA. No direct data are currently available concerning the structure of this complex. Due to the highly compact genome organisation of hepadnaviruses, the sequence encoding ε is involved in multiple additional functions; for instance, ε overlaps with the coding region for the precore protein and with regulatory cis-elements. For the human HBV experimental assays are very limited. Duck HBV (DHBV), by contrast, allows examination of the ε-sequence on all levels, starting from the in vitro characterisation of the interaction with the polymerase through to the complex interplay of the multiple ε-sequence functions in the authentic host in vivo.
The interaction between ε-RNA and polymerase, indispensable for all subsequent replication steps, relies on a characteristic structure which is conserved in all hepadnaviruses and consists of the lower stem, the bulge, which serves as the template for the primer, the upper stem and the apical loop. The bulge and the loop are, according to previous data, important for polymerase-binding; little is known, however, about the role of the upper stem. In all orthohepadnaviruses and DHBV this region is nearly completely base-paired and structurally rigid, in most avihepadnaviruses, by contrast, it is not. It is still unknown whether the upper stem sequence contributes actively to the exact placement of the polymerase over the initiation site in the bulge, or just physically links bulge and loop; even then could the specific upper stem sequence be important for other biological functions.
To test these hypotheses expression vectors for variant DHBV genomes with massively altered upper stem sequences were created, based upon sequences that previously had been selected for their ability to bind to the polymerase in vitro. First, the variant genomes were analysed for principal replication competence in transfected chicken hepatoma cells (LMH). Where applicable, virions produced by the transfected cells were used to infect primary duck hepatocytes (PDH) and eventually ducklings. All viruses with sequences that showed detectable in vitro priming activity were replication competent and infectious in vivo; however, differences to the wild-type virus in replication efficiency were much more pronounced in vivo than in transfected cells. As most variants had been infectious in vivo, it became possible to examine the in vivo evolution of new variants in serial passages. Despite the general genetic stability revealed by these studies one of the variants showed adaptive mutations within the ε region that improved replicaton and infection efficacy. Coinoculation experiments with the original variant confirmed the enhanced fitness of the new variants, which partly correlated with improved in vitro priming efficiency. In direct competition, however, none of the original and only one in vivo evolved ε-variants – inoculated in large excess – could, despite wildtype level in vitro activity, compare with DHBV/wt in vivo.
In general these data suggest that the authentic ε-sequence, optimised by a long coevolution with the host, provides DHBV/wt with advantages that, in part, could neither be detected in in vitro assays nor in the in vivo monoinfection. The multitude of different possibilities, amongst them the role of the host immune system, severely hampers the elucidation of underlying mechanisms. On the other hand, the sometimes very clear correlation between in vivo fitness and in vitro priming and replication capacity did allow for conclusions about the fundamentally important ε:polymerase interaction. To date almost all knowledge about the individual roles of the upper stem nucleotides relied exclusively on in vitro data, important aspects of which were here confirmed in vivo. The in vivo evolved variants led to new insights concerning the function of the apical loop. The in vivo SELEX assay further allowed the identification of important loop nucleotides in a very short time; within few weeks, a single loop sequence, coinciding in 5 of 7 nucleotides with the wt-sequence, was selected. For future characterisation of the ε:polymerase interaction the in vivo SELEX lends itself as the method of choice.


SWD-Schlagwörter: Hepatitis-B-Virus
Freie Schlagwörter (deutsch): Enten-Hepatitis-B-Virus , RNA-Verpackungssignal , Epsilon , Evolution , Varianten
Freie Schlagwörter (englisch): Duck-Hepatitis-B-Virus , RNA encapsidation signal , Epsilon , Evolution , Variants
Institut: Max-Planck-Institut für Immunbiologie
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Martin, Stefan (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 17.08.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 31.08.2010
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