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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-77112
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/7711/


Knust, Zeynep

The uptake of the Escherichia coli toxin Cytotoxic Necrotizing Factor 1 into host cells

Die Aufnahme des Escherichia coli Toxins Cytotoxisch Nekrotisierender Faktor 1 in Wirtszellen

Dokument1.pdf (6.552 KB) (md5sum: 4d7ff7b399bd5935b936c6cc6b5921c0)

Kurzfassung in Englisch

The Cytotoxic Necrotizing Factor 1 (CNF1) is a protein toxin produced by extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) strains. It plays an important role in E. coli colonization of the bladder and the urinary tract. Moreover, this toxin is associated with strains which play a role in soft tissue infections and invasion into the brain (meningitis). CNF1 modifies small GTPases of the Rho family by deamidation of a glutamine at position 63, which is crucial for the hydrolysis of GTP. This results in the formation of a constitutive active Rho-protein leading to the destruction of the epithelial barrier and a phagocytic behaviour of infected cells.

In this thesis, the uptake of CNF1 into target cells was studied. CNF1 is taken up into cells by receptor-mediated endocytosis via the laminin receptor. The toxin is endocytosed into early endosomes and undergoes a change in protein conformation once the endosomal compartment is acidified to pH values of 5 to 6. The exposure of hydrophobic regions, allows the toxin to insert into the vesicle membrane. The CNF1 loop, which connects H1 with H2 and consists of about ten mainly negatively charged amino acids, is a critical region within the toxin. Mutations to positive residues cause decrease of CNF1 toxicity, as it was shown for E382K/E383K. The whole process of CNF1 translocation is dependent on the pH decrease and could be inhibited with bafilomycin, an inhibitor for vesicular proton pumps.
After membrane insertion, CNF1 seems to form pores, as it could be concluded from the black lipid bilayer experiments. It was not clarified if these pores consist of one or more toxin molecules, but since not only ions but also the whole C-terminus of the toxin has to be translocated through this pore, it can be assumed that CNF1 oligomerizes in endosomes.
CNF1 containing early endosomes tend to fuse and swell. This early endosome enlargement was only observed with CNF1 but not with CNF3 and CNFy. The endosome enlargement is also inhibited in intoxications with the pore-forming deficient mutant of CNF1. This gives a strong hint that the endosome swelling is caused by an unknown activity of the CNF1 translocation domain.
The catalytic domain of CNF1 is translocated into the cytosol together with an unknown domain with a size of about 20 kDa. The cleavage occurs via a serine protease in the amino acid region 536-542 and results in a C-terminal fragment of 55 kDa. This fragment is soluble in the cytosol and is not further degraded. The cleavage site shows no similarities to known protease sites, therefore the 20 kDa domain with the unknown function might exhibit the protease which is responsible for CNF1 processing similar to the cleavage of other autocatalytic active AB-toxins (e.g. C. difficile toxins A and B).
The catalytic domain of the C2 toxin from C. botulinum requires heat-shock proteins for translocation from the endosomes and subsequent refolding. In contrast, the translocation of CNF1 is independent of hsp90. Moreover, CNF1 is able to renature by itself when the toxin is kept at physiologic conditions after acidity driven denaturation.
The importance of the cleavage for the toxin activity was shown in vivo. Only toxin capable of membrane insertion and processing acted on these cells efficiently, while mutations in the loop or cleavage site resulted in at least 10x lower toxicity.


Kurzfassung in Deutsch

Der Cytotoxisch Nekrotisierende Faktor 1 (CNF1) ist ein Protein, welches von extraintestinalen pathogenen Escherichia coli (ExPEC) Stämmen produziert wird. CNF1 spielt eine bedeutende Rolle bei der Kolonisierung der Harnwege und der Blase. Darüber hinaus wird dieses Toxin in Bakterienstämmen produziert, welche Wundinfektionen und Meningitis hervorrufen. CNF1 modifiziert kleine GTPasen der Rho Familie. Glutamin 63, eine für die GTP-Hydrolyse essenzielle Aminosäure, wird durch CNF zu Glutamat deamidiert. Rho wird hierdurch konstitutiv aktiviert. Dies führt unter anderem zu einer Zerstörung des Epithels und zur Phagozytose in normalerweise nicht phagozytierenden Zellen.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Aufnahme von CNF1 in die Wirtszelle charakterisiert. CNF1 wird über den Laminin-Rezeptor durch Endozytose aufgenommen. Der leicht saure pH-Wert (pH 5-6) in den frühen Endosomen führt zu einer Konformationsänderung des Toxins: Hydrophobe Bereiche werden ausgestülpt und inserieren in die vesikuläre Membran. Der CNF1-Loop, welcher Helix 1 und Helix 2 miteinander verbindet und überwiegend aus negativ geladenen Aminosäuren zusammengesetzt ist, stellt eine wichtige Region im Protein dar. Jegliche Mutationen im Loop zu positiv geladenen Aminosäuren resultieren in einer reduzierten Toxin-Aktivität. Der gesamte Prozess der CNF1 Translokation ist zudem abhängig von der endosomalen Ansäuerung, die Aufnahme des Toxins kann daher durch Bafilomycin A1, einem Inhibitor für vesikuläre Protonenpumpen, blockiert werden.

Nach der Insertion in die vesikuläre Membran bildet CNF1 porenähnliche Strukturen, die einen Ionendurchfluss erlauben. Dies konnte durch die Experimente mit künstlichen Membranen gezeigt werden. Ob diese Poren aus einem oder mehreren Toxinmolekülen bestehen, konnte bisher nicht abschließend geklärt werden. Da jedoch der gesamte CNF1 C-Terminus durch diese Öffnung transloziert werden muss, liegt eine CNF1 Oligomerisierung in den Endosomen nahe.

Frühe Endosomen, die CNF1 aufgenommen haben, sind morphologisch von Ensodomen ohne Toxin unterscheidbar, da CNF1 zur Fusion und Vergrößerung dieser Endosomen führt. Dieses Schwellen der frühen Endosomen konnte lediglich nach Behandlung von Zellen mit CNF1, nicht jedoch mit CNF3 oder CNFy beobachtet werden. Ebenfalls tritt dieser Phänotyp nicht bei einer Intoxikation mit CNF1-Mutanten auf, deren Translokationsdomäne mutiert wurde. Die erhöhte Fusion von frühen Endosomen ist demnach eine Reaktion auf eine unbekannte Aktivität in der CNF1 Translokationsdomäne.

Von den frühen Endosomen wird ein ca. 55 kDa großes Stück des CNF1 C-Terminus ins Cytosol transloziert. Neben der katalytische Domäne (720-1014) enthält dieses Fragment eine weitere ca. 20 kDa große Domäne mit bisher unbekannter Funktion. Die Spaltung von CNF1 geschieht durch eine Serinprotease zwischen den Aminosäuren 536-542. Dieses Fragment liegt im Cytosol als lösliches Protein vor und wird nicht weiter prozessiert. Die Schnittstelle zeigt keine Ähnlichkeit zu bekannten Serinprotease-Schnittstellen. Es ist daher anzunehmen, dass die 20 kDa Domäne eine CNF1 interne Protease darstellt, ähnlich zu anderen autokatalytisch aktiven AB-Toxinen (z.B. Toxine A und B aus C. difficile).

Die katalytische Domäne des C2-Toxins aus C. botulinum benötigt das Hitzeschock-Protein Hsp90, welches für die Translokation der katalytischen Domäne aus dem Endosom und dessen Rückfaltung essenziell ist. Im Gegensatz dazu ist die CNF1-Aufnahme unabhängig von Hsp90. Sauer denaturiertes CNF1 kann sich bei physiologischen pH-Werten vielmehr selbständig rückfalten und zeigt eine vergleichbare Aktivität wie vor der Denaturierung.

Die Bedeutung der CNF1-Prozessierung wurde in vivo gezeigt: Lediglich wildtyp-CNF1 zeigt eine effiziente Vergiftung von kultivierten Zellen, während Mutationen der Schnittstelle oder der Translokationsdomäne zu einer mindestens 10x verminderten Toxin-Aktivität führten.


SWD-Schlagwörter: Toxin , Escherichia coli , Endosom
Freie Schlagwörter (englisch): CNF , ExPEC , Rho , GTPase
Institut: Inst. für Pharmakologie und Toxikologie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Friedrich, Thorsten (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 12.05.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 15.09.2010
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