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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-78218
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/7821/


Becker, Claude

RNAi-mediated gene silencing by small non-coding RNAs in protoplasts of Arabidopsis thaliana

RNAi vermittelte Regulierung der Genfunktion unter Verwendung von nicht kodierenden RNAs in Protoplasten von Arabidopsis thaliana

Dokument1.pdf (2.896 KB) (md5sum: 7f6bdd508ff7a28c3f85c2f398cea90a)

Kurzfassung in Englisch

Artificial microRNAs (amiRNAs) directed against a specific gene or a combination of genes offer the possibility to study loss-of-function effects in stable transgenic lines. However, amiRNA efficacy is highly variable and the parameters for amiRNA design are not fully understood. The analysis of gene regulation by artificial microRNAs presented in this study (Chapter II) has led to two major results. First, the efficiency with which a given amiRNA silences its respective target gene could be assessed in a transient assay in plant protoplasts. Hence, efficient amiRNAs can be pre-selected in a rapid and simple transient assay; amiRNAs leading to only weak reduction of target gene expression can be specifically selected in cases where mild silencing effects are desired. This constitutes a major improvement in the generation of transgenic RNAi lines and leads to higher ease in gene silencing studies. Second, using the single-cell system presented in this work, the influence of target mRNA structure and amiRNA-target hybrid constellation on amiRNA efficacy was systematically analyzed. A stable secondary structure of the target mRNA in the region of the amiRNA binding site thus seemed to favor amiRNA-mediated gene silencing whereas an open, flexible structure was inhibiting to the amiRNA activity. These results offer the possibility of (i) an improved amiRNA design and (ii) a mechanistic insight into miRNA-mediated inhibition of gene expression.
In experiments on single animal cells, RNAi can be induced by transfecting the cells with short interfering RNAs (siRNAs). Reverse genetic screens and functional gene analysis have thus been performed. However, RNAi studies in single plant cells have so far played a marginal role. Two advances in the directed gene silencing by siRNA transfection of single plant cells are described in this thesis (Chapter III). First, a protocol for the efficient transfection of Arabidopsis mesophyll protoplasts was established and siRNA uptake was monitored. Labeled siRNAs marked areas in the cytosol; the identification of the latter might give new information on endocytic trafficking pathways and/or on a potential link between RNAi machinery and intracellular compartments. The second advance reported in this part of the thesis is the first observation of siRNA-mediated gene knock-down in single cells from Arabidopsis thaliana. The independent efficient knock-down of two different reporter genes in mesophyll protoplasts constituted the proof-of-principle experiment for gene silencing by siRNA transfection into these cells and prepares the ground for RNAi screening experiments. The silencing of endogenous genes by siRNA transfection and a putative non-specific silencing of off-target genes still need to be further investigated.
Additionally to the conclusions on amiRNA- and siRNA-mediated gene silencing presented above, this study has also led to a number of technical advances in the context of single cell analysis in the plant field (presented in Chapter IV). The generation of novel vectors for simultaneous transient expression of multiple constructs facilitates protoplast transformation by making multiple transformations obsolete while simultaneously guaranteeing identical copy numbers for all templates. The optimization of protoplast transformation protocols allowed the parallel transformation of multiple samples with low amounts of plasmid DNA. For the first time, a platform for long-term observation via high-content microscopy is presented. In combination with novel pipelines for the systematic image-based identification and analysis of cellular features, it constitutes a powerful tool for high-throughput screens on plant single cells.
In summary, the present work has contributed to the comprehension of small ncRNA-mediated gene silencing and to the advance of RNAi techniques as well as single cell analysis in plants. It (i) hints at a potential mechanistic explanation to miRNA-target recognition, (ii) introduces a pipeline for validation of RNAi-inducing constructs and presents (iii) a method for siRNA-mediated gene silencing in plant protoplasts as well as (iv) a versatile technical platform for plant single-cell analysis.


Kurzfassung in Deutsch

MicroRNAs (miRNAs) sind endogene nicht-kodierende RNAs (ncRNAs) und an der Kontrolle zahlreicher pflanzlicher Entwicklungsprozesse beteiligt. Basierend auf Sequenzhomologie inhibieren miRNAs die Expression des jeweiligen Zielgens. Artifizielle microRNAs (amiRNAs) nutzen die bekannten Charakteristika und die Przoessierungsmaschinerie natürlicher miRNAs und können für experimentelle RNA Interferenz (RNAi) genutzt werden. Aus bisher ungeklärten Gründen ist die Effizienz solcher amiRNA-Konstrukte sehr variabel und nur schwer vorhersagbar.
Short interfering RNAs (siRNAs) sind 20-24 Nukleotide lang und können verschiedenen Ursprungs sein. Die Transfektion von Zellen mit synthetischen siRNA Duplexen ist eine Standardtechnik für RNAi in tierischen Zellsystemen und wird in sog. „reverse genetics screens“ eingesetzt. Systematische Genregulierung in pflanzlichen Modellsystem Arabidopsis thaliana mittels siRNAs ist bisher nicht bekannt.
In der vorliegenden Dissertation wurde eine experimentelle Plattform zur ncRNA-vermittelten Genregulation in Protoplasten von Arabidopsis entwickelt. Diese Plattform beinhaltet eine Transfektion der Zellen mit minimalen Mengen an Plasmid-DNA, ein automatisiertes Mikroskopieverfahren sowie eine computergestützte Bildanalyse zur Identifikation der Zellen und zur Messung der Fluoreszenzintensität.
Um die Effizienz von amiRNAs gegen ein bestimmtes Zielgen zu bestimmen wurde ein neues Vektorsystem entwickelt, welches die gleichzeitige transiente Expression der amiRNA, des an einen fluoreszenten Reporter gekoppelten Zielgens sowie eines Transformationsmarkers erlaubt. Anhand dieses Systems war es möglich, effiziente amiRNAs im Vorfeld zu identifizieren und sie erfolgreich in planta einzusetzen. Zusätzlich konnten in einer systematischen Analyse von Strukturen und Sequenzeigenschaften der amiRNA und ihrer jeweiligen Bindestelle in der Zielgensequenz Parameter bestimmt werden, welche die Effizienz beeinflussen.
Des weiteren wurde ein effizientes Transfektionsverfahren für siRNAs in Arabidopsis Protoplasten entwickelt. Die Aufnahme fluoreszent markierter siRNAs konnte verfolgt und ihre Lokalisierung in intrazellulären Strukturen beobachtet werden. In sog. „proof-of-principle“ Experimenten konnte gezeigt werden, dass siRNAs in diesen Zellen erfolgreich zur Regulation von Zielgenen eingesetzt werden können.
Die vorliegende Dissertation trägt zu einem erweiterten Verständnis der ncRNA basierten Genregulationsmechanismen bei. Sie beinhaltet außerdem Fortschritte in der Entwicklung von RNAi Techniken und in der Analyse von Einzelzellen bei Pflanzen. Die Hauptpunkte sind eine (i) mögliche Erklärung für den Mechanismus der miRNA-Zielgen-Interaktion, (ii) ein experimenteller Rahmen für die Validierung und systematische Analyse von RNAi Kontrukten, (iii) eine Methode für siRNA vermitteltes „gene silencing“ in Protoplasten sowie (iv) eine vielseitige technische Plattform für die Einzelzellanalyse bei Pflanzen.


SWD-Schlagwörter: Small RNA , RNS-Interferenz , Non-coding RNA , Ackerschmalwand , Protoplast
Freie Schlagwörter (englisch): short interfering RNA , microRNA
Institut: Institut für Biologie 2
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Palme, Klaus (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.02.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 08.12.2010
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