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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-79157
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/7915/


Baader, Johannes

Polysaccharid-Microarrays mit optoelektronischer Ausleseeinheit

Polysaccharide microarrays with optoelectronic detection units

Dokument1.pdf (7.341 KB) (md5sum: 35104df0c37d55f2d5be6d603cf4250e)

Kurzfassung in Deutsch

Microarray-basierte Testsysteme erlangen zunehmende Bedeutung in der medizinischen Multi-Parameter-Diagnostik, besonders dort, wo das verfügbare Probenvolumen begrenzt ist. Häufig sind diese Microarrays auf Glas- oder Kunststoffträgern realisiert und damit nur mittels externer Messinstrumente, wie beispielsweise Fluoreszenz-Scanner, auslesbar. So stellen insbesondere Signaldetektion und -auswertung große Herausforderungen bei der Entwicklung von tragbaren, Microarray-basierten Systemen dar. Solche Systeme weisen kurze Messzeiten auf und wären daher von großem Nutzen für Hochdurchsatzmessungen, wie sie unter anderem für die routinemäßige Bestimmung des Immunstatus eines Patienten nach einer Impfung erforderlich sind. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur Realisierung eines hochempfindlichen Microarrays auf Basis eines Fotodiodenarrays, welcher in einem komplementären Metall-Oxid-Halbleiter-Prozess (CMOS) hergestellt wird und elektronisch ausgelesen werden kann. Diese Chips bestehen aus einem Array von Silizium-Fotodioden mit jeweils einem Durchmesser von 180 Mikrometern. Auf den (Siliziumdioxid-)Oberflächen dieser Chips werden winzige Mengen unterschiedlicher Kapselpolysaccharide des Bakteriums Streptococcus pneumoniae gedruckt. Diese Biofunktionalisierung der Diodenoberfläche ermöglicht den empfindlichen Nachweis von Antikörpern gegen den Krankheitserreger in Flüssigkeiten wie beispielsweise menschlichem Blutserum. Streptococcus pneumoniae gilt weltweit als Hauptverursacher bakterieller Infektionen. Da dieserart Infektionen mit einer hohen Mortalität einhergehen und zunehmend antibiotikaresistente Bakterienstämme in Umlauf kommen, werden für breite Bevölkerungsschichten Impfungen gegen S. pneumoniae durchgeführt. Jedoch ist die Wirksamkeit dieser Impfungen eingeschränkt, und so sollte der Immunstatus der geimpften Person routinemäßig überwacht werden.
Zur Bestimmung der Pneumokokken-IgG-Antikörperkonzentrationen in einer Blutprobe wird auf diesem Polysaccharid-Microarray ein Immunsorptions-Assay (ELISA) durchgeführt, zu dessen Detektion eine Chemilumineszenzreaktion dient. Dabei ist insbesondere die robuste Anbindung der Polysaccharide auf dem Chip eine Voraussetzung zur Durchführung reproduzierbarer und somit quantitativer Messungen. Daher werden unterschiedliche Ansätze für eine stabile Immobilisierung der Polysaccharid-Antigene auf dem Chip vorgestellt und die Qualität der Immobilisierungsreaktion hinsichtlich der Leistungsfähigkeit des Biosensors untersucht. Um zu prüfen ob dieser Biosensor für diagnostische Anwendungen geeignet ist, werden die analytische Spezifität und Sensitivität, der dynamische Messbereich, die Reproduzierbarkeit, Konsistenz und Präzision der Messung, die Langzeitstabilität und die Anfälligkeit des Biosensors gegenüber Veränderungen in der Umgebungstemperatur untersucht. Es zeigte sich, dass durch die Wahl einer geeigneten Standard-Prozedur eine zeitliche Änderung im Ansprechverhalten der Chips mit fortdauernder Lagerzeit vermieden werden kann, was die Kalibrierung der Polysaccharid-Microarrays ermöglicht. Dies erlaubt die Durchführung quantitativer Konzentrationsbestimmungen der Analyt-Moleküle in menschlichem Blutserum. Die Richtigkeit der mit dieser Messmethode erzielten Ergebnisse wurde anhand einer klinischen Studie mit 30 Patientenseren überprüft, welche ebenfalls durch die Referenzmethode, einem gemäß eines WHO-Protokolls durchgeführten Pneumokokken-ELISAs, analysiert worden waren. Durch eine systematische Analyse der auf die Immunassays einwirkenden Störgrößen und eine Anpassung des Chip-basierten Pneumokokken-Assays konnte eine gute Korrelation in den Ergebnissen der beiden unterschiedlichen Testsysteme erreicht werden. Die dabei gewonnenen Erkenntnisse sind ganz allgemein bei der Übertragung eines Standard-Immunassays auf einen Chip-basierten Ansatz hilfreich.
Auch wenn die Herstellungskosten des Biosensors vergleichsweise gering sind, kann eine Regenerierung und Wiederverwendung der Polysaccharid-Microarrays gewünscht sein. Daher werden in dieser Arbeit ein chemisches, ein biologisches und ein elektrochemisches Verfahren zur Ablösung und Entfernung der an das Array gebundenen Proteine präsentiert. Neben seiner Verwendung als analytisches Werkzeug für immunologische Fragestellungen kann der Ansatz eines biofunktionalisierten Fotodiodenarrays auch auf ein weiteres Anwendungsfeld übertragen werden. So wird beispielhaft die erfolgreiche Verwendung eines derartigen Chips zum Nachweis von Glucose in wässriger Lösung gezeigt.
Das in dieser Arbeit vorgestellte Array aus miniaturisierten und in den Chip integrierten Fotodioden zur Umwandlung von Licht in ein proportionales Spannungssignal stellt ein schnelles und hochempfindliches Analysewerkzeug dar, mit welchem ein Multiplex-Pneumokokken-Antikörper-Nachweis in einer verdünnten humanen Serumprobe durchgeführt werden kann. Dieser Biosensor ist somit für Hochdurchsatz-Messungen einsetzbar. Da die Lumineszenzsignale durch eine direkt auf dem lichtempfindlichen Halbleiter ablaufenden enzymatisch-chemischen Reaktion generiert werden, bedarf es keiner externen Quellen zur Erzeugung der Signale, wodurch das Messsystem kleine Abmessungen und eine geringe Leistungsaufnahme aufweist. Diese Eigenschaften machen es zu einem geeigneten Werkzeug für die Anwendung in der patientennahen Labordiagnostik.


Kurzfassung in Englisch

Microarray based test assays have become increasingly important tools in diagnostics for fast multi-parameter detection especially where sample volumes are limited. Commonly these microarrays use glass or plastic slides as supporting substrates and thus can only be analyzed by macroscopic external scanners. Thus inter alia signal detection poses a challenge for the development of portable, microarray based systems with integrated signal analysis and fast time-to-result capabilities. Such systems would be of great benefit for e. g. high-throughput immune status analysis which is required for monitoring of vaccination success. This work describes a simple procedure to create highly sensitive microarrays by using an integrated, complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) based electric signal readout process. To accomplish this chips are used which consist of an array of silicon photodiodes with a diameter of approx. 180 µm and where minute amounts of different types of bacterial capsule polysaccharides are printed on the (silicon dioxide) surface of the diode. With these chips a highly sensitive detection for antibodies against the bacterium Streptococcus pneumoniae in human blood serum is feasible. As this bacterium is a leading cause of hospitalization and mortality worldwide vaccination is recommended for a broad class of population. Yet the efficacy of the vaccination is poor and the immune status of a vaccinee should be monitored routinely.
The polysaccharide microarrays are used for an ELISA-on-chip approach where the quantitative measurement of IgG antibody concentrations in human blood sera is enabled by using a chemiluminescence based detection. Therefore a robust polysaccharide immobilization on the chip is a prerequisite for reproducible and quantitative measurements. Hence, different approaches for a stable binding of the polysaccharide receptors on the chip are presented and their impact on the biosensor assay is investigated. To determine the feasibility of the new biosensor concept as a future diagnostic device its performance was characterized: The analytical specificity and sensitivity, the dynamic measurement range, the reproducibility, consistency and precision of the measurements, the long-term stability and the susceptibility of the biosensor to changes in reaction temperatures were all tested and classified. By a simple process modification the chips´ responding behavior could be fixed at a constant level thereby allowing a batch-wise calibration procedure of the polysaccharide microarrays and the conduct of a quantitative determination of the analytes´ concentrations in real serum samples. This was confirmed when a clinical survey comprising the blood sera of 30 human patients was performed to evaluate the agreement of biosensor test results with the reference enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Interferences in immunoassays are discussed and their impacts on the consensus of test results of the two different test systems compared are carefully investigated. As a result of this investigation, significant improvements of the accuracy of the biosensor could be made leading to a high correlation with the ELISA method. Thus these findings on possible interferences of chip based immunoassays may be of a certain interest whenever an ELISA test shall be transformed to a modern miniaturized sensing platform such as a microarray.
Even though the rather low fabrication costs should pose no hurdle for a market success of the biosensor, one can be interested in the implementation of a reusability of the polysaccharide microarray. Therefore chemical, biological and electrochemical procedures are presented for stripping-off the proteins bound to the polysaccharide microarray. Besides its feasibility as an analytical tool for immune diagnosis the photodiode array can also be used for further questions. Exemplarily its usage is shown for the detection of glucose within an aqueous solution.
By using an array of miniaturized, chip-integrated photodiodes for the conversion of light into a proportional voltage signal a fast and highly sensitive analytical device was generated for the multiplexed pneumococcal antibody detection in diluted human serum. This makes the semiconductor based microarray a suitable device for high-throughput measurements. As the luminescence is generated by a chemical reaction directly on top of the light sensitive semiconductor area no external stimulus for signal generation is required. Thereby the biosensor has small dimensions and low power consumption which make it suitable for the application in point-of-care testing.


SWD-Schlagwörter: Biosensor , Microarray , Polysaccharide , Serodiagnostik , Bedside-Methode , Integrierte Optoelektronik
Freie Schlagwörter (englisch): biosensor , microarray , polysaccharide , diagnostics , point-of-care , optoelectronics
PACS Klassifikation Biosensor , MEMS
Institut: Institut für Mikrosystemtechnik
Fakultät: Technische Fakultät (bisher: Fak. f. Angew. Wiss.)
DDC-Sachgruppe: Technik
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Rühe, Jürgen (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.12.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 20.01.2011
Bemerkung: Diese Arbeit ist als Buch erhältlich: 'Polysaccharid-Microarrays mit optoelektronischer Ausleseeinheit. Oberflächenchemie und -physik von Mikrosystemen Bd. 13' bei Der Andere Verlag (ISBN 978-3-86247-110-2).
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