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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-79239
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/7923/


Müller, Catrin Swantje

Die Proteinnetzwerke der Cav2-Familie spannungsgesteuerter Calciumkanäle

Protein networks of the Cav2-family of voltage-activated calcium channels

Dokument1.pdf (26.555 KB) (md5sum: 64ecc1421c1ee2eeaf2992aa5c9b5c42)

Kurzfassung in Deutsch

Die spannungsgesteuerten Calciumkanäle der Familie 2 (Cav2) sind an vielen verschiedenen Prozessen des zellulären Metabolismus und der Zell-Zell-Kommunikation, wie Regulation der Genexpression, Neurotransmitterfreisetzung oder Hormonausschüttung, beteiligt. Zur Erfüllung dieser Aufgaben, sind die Calciumkanäle auf die Interaktion mit anderen Proteinen angewiesen, die die Calciumsignale der Kanäle aufnehmen, weiterleiten, die Kanalfunktion modulieren und so für einen hochspezifischen und zeitlich wie räumlich präzisen Ablauf der Prozesse sorgen. Es wird angenommen, dass das Proteom eines Calciumkanals, also jene Proteine, die sich innerhalb eines Radius von wenigen Nanometern bis zu einigen hundert Nanometern um den Kanal herum befinden, über die Integration und Weiterleitung des Calciumsignals entscheiden. Dieses Proteom ist bislang weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb diese Umgebung der Cav2-Kanäle im Nagerhirn unter nativen Bedingungen qualitativ und quantitativ analysiert. Zunächst wurden Methoden zur Präparation des Versuchsmaterials und zur Solubilisierung der Calciumkanäle optimiert und ein Multiepitop-Versuchsansatz für Immunaffinitätsreinigungen entwickelt. Für die relative massenspektrometrische (MS) Quantifizierung von immunaffinitätsgereinigten Proteinkomplexen aus nativem Gewebe wurde eine neue, peakvolumenbasierte und markierungsfreie Methode mit einer verbesserten Linearität über drei bis vier Größenordnungen etabliert. Eine Arbeit über die markierungsfreie MS-Quantifizierung von Proteinaffinitätsreinigungen wurde zur Veröffentlichung eingereicht (Bildl et al. - Extending the dynamic range of label-free mass spectrometric quantification for evaluation of affinity purifications). Die optimierten Methoden wurden zur Reinigung der schwer löslichen Calciumkanäle mit zuvor charakterisierten Antikörpern gegen alpha- und beta-Untereinheiten des Calciumkanalkomplexes aus Maus- und Rattenhirngewebe verwendet und die Ergebnisse mithilfe von Kontrollen aus Knockoutgewebe bzw. IgG-Reinigungen ausgewertet. Aus der direkten Umgebung der Calciumkanäle konnten etwa 200 Proteine, die in Proteinnetzwerken direkt oder indirekt mit den Cav2-Kanälen interagieren, identifiziert und quantifiziert werden. Die gefundenen Cav2-Interaktionspartner wurden hinsichtlich ihrer biochemischen Funktionen, Topologie, relativen Menge und Präferenz für die Subtypen der Cav2-Kanäle analysiert und klassifiziert. Während aus der Literatur bereits bekannte Interaktionspartner der Cav2-Kanäle bestätigt werden konnten, wurde eine große Zahl an neuen Netzwerkkomponenten gefunden, die bisher noch nicht mit den Kanälen in Verbindung gebracht worden waren. Die Ergebnisse wurden in einer umfassenden Arbeit veröffentlicht (Müller et al. - Quantitative proteomics of the Cav2 channel nano-environments in the mammalian brain; als featured article in Proc Natl Acad Sci USA 107, 2010). Die methodischen Entwicklungen und die Ergebnisse dieser Dissertation tragen dazu bei, die Integration der spannungsgesteuerten Cav2-Kanäle in Netzwerke aufzuklären, die Zusammensetzung und Aufgaben dieser Netzwerke zu verstehen und die lokale Calciumsignalgebung innerhalb weniger hundert Nanometer um die neuronalen Calciumkanäle herum (Nanoumgebung) zu entschlüsseln. Für weitere proteomische Arbeiten zur Analyse von Proteinnetzwerken, insbesondere für Arbeiten über Membranproteine und deren Umgebung, setzt die vorliegende Dissertation einen Standard.


Kurzfassung in Englisch

Voltage-activated calcium channels of the subfamily 2 (Cav2) play a role in cellular metabolism and communication processes such as regulation of gene expression, neurotransmitter exocytosis or hormone secretion. To perform these tasks the calcium channels depend on interactions with other proteins that receive and transmit the channels’ calcium signals, modulate channel function and thereby allow for highly specific and precise spatio-temporal coordination of these processes. It is assumed that the calcium channel molecular nano-environment – i.e. the proteins located around the channel in a (radial) distance of tens to hundreds of nanometers – determine the integration and transmission of the calcium signal. The proteome of the nano-environment of the Cav2 channels yet unknown was therefore qualitatively and quantitatively analysed in rodent brain under native conditions. First, methods for source material preparation and solubilization of the Cav2 channels were optimized, and a multi-epitope immunoaffinity purifications approach was developed. For relative mass spectrometric (MS) quantification of affinity purified proteins from native tissue, a novel label-free (peak volume-based) method was established providing an improved linearity over three to four orders of magnitude. This work on label-free MS quantification of protein affinity purifications was submitted for publication (Bildl et al. - Extending the dynamic range of label-free mass spectrometric quantification for evaluation of affinity purifications). The optimized methods were used to purify the poorly soluble calcium channels with thoroughly characterized antibodies directed against Cav2 alpha- and beta-subunits from mouse and rat brain tissue. The results were analysed with respect to control purifications using non-specific IgG or material obtained from animals with targeted deletions of the protein of interest. From the Cav2 channels’ nano-environments roughly 200 proteins interacting directly or indirectly with the channels were identified and quantified. The found Cav2 interaction partners were analysed and classified according to their biochemical function, topology, relative abundance and Cav2 subtype preference. While confirming interaction partners already known in literature, a wide number of new network components were identified that had previously not been considered as interaction partners of Cav2 channels. These results were published in a comprehensive work (Müller et al. - Quantitative proteomics of the Cav2 channel nano-environments in the mammalian brain; featured article in Proc Natl Acad Sci USA 107, 2010). The methodical developments and the results of this work help to better understand the integration of voltage-activated Cav2 channels in networks, the composition and the functions of these networks and the local calcium signalling processes occurring within a few hundreds nanometers around neuronal calcium channels. This work may also serve as a standard for similar proteomic projects aiming at the analysis of protein networks, especially for membrane proteins and their protein environments.


SWD-Schlagwörter: LC-MS , Proteomanalyse , Quantitative Analyse , Calciumkanal
Freie Schlagwörter (deutsch): spannungsgesteuerte Calciumkanäle , Multiepitop-Ansatz , Nanoumgebung
Freie Schlagwörter (englisch): proteome , quantitative mass spectrometry , nano-environment , voltage-activated calcium channels
Institut: Physiologisches Inst. II
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Fakler, Bernd (Prof. Dr.)
Quelle: Quantitative proteomics of the Cav2 channel nano-environments in the mammalian brain; Müller, C. S., Haupt, A., Bildl, W., Schindler, J., Knaus, H. G., Meissner, M., Rammner, B., Striessnig, J., Flockerzi, V., Fakler, B., and Schulte, U. Proc Natl Acad Sci USA 2010 Aug;107(34):14950-7
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 17.01.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 20.01.2011
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