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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-80168
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8016/


Schmidt, Cleber Alberto

Phytochemical and biological studies of Parapiptadenia rigida

Phytochemische und biologische Untersuchungen von Parapiptadenia rigida

Dokument1.pdf (11.502 KB) (md5sum: 6d90bd029f7c4f020b1ae0b2a1e074d9)

Kurzfassung in Englisch

In Brazil traditional medicinal plants have been used to treat several diseases. Often their active compounds and / or their mode of action are unknown. To enhance the knowledge on Brazilian medicinal plants the following studies have been undertaken:
Eighty-four extracts from 40 plant species used in traditional medicine in the south of Brazil were screened for their antibacterial, cytotoxic and apoptotic properties and for their effect on NF-kB DNA binding using different cell-based assays. The ethanolic extract of the bark from P. rigida (Benth.) Brenan (Fabaceae) was selected as a promising sample to find out the active secondary metabolites responsible for its biological activity.
The bark from P. rigida was phytochemically studied for the first time and 15 catechin derivatives were isolated. Structure elucidaton of all compounds, in their underivatized forms, was accomplished by a combination of 1D and 2D NMR spectroscopy, circular dichroism (CD), and mass spectrometry methods and led to the identification of 4',3"-di-O-methylapocynin-B (1), 4',3"-di-O-methylapocynin-D (2), epigallocatechin-3-O-ferulate (3), 4'-O-methylepigallocatechin-3-O-ferulate (4), 4'-O-methylepigallocatechin-3-O-gallate (5), 4'-O-methylepicatechin-3-O-gallate (6), epicatechin-3-O-gallate (7), epigallocatechin-3-O-gallate (8), 3'-O-methylepicatechin (9), 4'-O-methylepigallocatechin (10), 4'-O-methylgallocatechin (11), epigallocatechin-(4beta-8)-4'-O-methylgallocatechin (12), epicatechin-(4beta-8)-4'-O-methylgallocatechin (13), 4'-O-methylgallocatechin-(4alfa-8)-4'-O-methylgallocatechin (14), and epigallocatechin-(4beta-8)-epigallocatechin-3-O-gallate (15). Interestingly, nearly all compounds were methylated which has rarely been observed in nature up to now. Compounds 1 to 6 and 12 to 14 were described for the first time as secondary plant metabolites. The conformational behavior of dimers 12 to 15 was studied by computed modeling using molecular mechanics (MM+) calculations. The different conformational possibilities of the heterocyclic rings and the interlinkage rotation of these compounds were compared with their measured NMR data. A preferential conformation of the heterocyclic C-ring between a C(2)-sofa and half-chair and the F ring in a half-chair conformation with rings B and E in a quasi-equatorial orientation was observed in all cases. The dimers 12, 13, and 15 with a 4R-configuration (= beta) showed a preferential compact conformation. 14 with a 4S-configuration (= alfa) exhibited either a compact or an extended rotameric conformation.
A suitable HPLC-DAD method with RP-18 was used to quantify most of the isolated compounds in the extract, and the 4'-O-methylgallocatechin (11) was identified as the main catechin derivative in the extract.
The extract and the isolated compounds were tested for their wound healing properties in a fibroblast scratch assay. The extract significantly increased the migration and proliferation of the cells at 10 µg/mL, whereas a higher concentration decreased the cell number, probably due to cytotoxic effects. The isolated catechin derivatives, in general, exhibited a significant stimulatory activity within concentrations of 1 µM to 10 µM. Compounds 5, 6 and 7 containing a galloyl moiety were the most active ones. The transcription factor NF-kB and the kinase p38 MAPK play a central role in inflammatory pathways. Therefore, the extract and some isolated compounds were tested for their influence on these proteins. In the NF-kB EMSA assay, compounds 1 (4',3"-di-O-methylapocynin-B) and 3 (epigallocatechin-3-O-ferulate) showed the highest inhibitory activity at concentrations of 10 µM and 20 µM. A moderate dose-dependent inhibitory activity on NF-kB was observed in the other cases. All compounds exhibited no cytotoxic effect at the concentrations used. Compounds 7 (epicatechin-3-O-gallate) and 8 (epigallocatechin-3-O-gallate) showed the highest inhibitory activity on p38 MAPK. The moderate inhibitory effects on NF-kB and p38 MAPK activation may be beneficial in the initial phase of the wound healing process as well as explain anti-inflammatory properties in other skin injuries. Altogether, these results may contribute to explain the wound healing and anti-inflammatory properties of the bark from P. rigida, with the catechin derivatives as the most effective compounds being responsible for these properties. However, in vivo studies should also be performed for final conclusions.


Kurzfassung in Deutsch

Phytochemische und biologische Untersuchungen von Parapiptadenia rigida
Cleber Alberto Schmidt, Februar 2011

In Brasilien werden vielfach traditionelle Arzneipflanzen zur Behandlung von Krankheiten verwendet. Oft sind ihre Wirkstoffe und ihr Wirkmechanismus nicht bekannt. Um die Kenntnisse über brasilianische Arzneipflanzen zu erhöhen, wurden die folgenden Untersuchungen durchgeführt:
48 Extrakte von 40 Pflanzenarten, die in der traditionellen Medizin in Südbrasilien verwendet werden, wurden auf ihre antibakteriellen, zytotoxischen und apoptotischen Eigenschaften sowie auf ihren Effekt auf die NF-kB DNA-Bindung in zellbasierten Assays untersucht. Der Ethanolextrakt aus der Rinde von P. rigida (Benth) Brenan (Fabaceae) wurde als vielversprechend ausgewählt, um die aktiven, für die biologische Aktivität verantwortlichen Sekundärmetabolite zu finden.
Die Rinde von P. rigida wurde erstmals phytochemisch untersucht und 15 Catechinderivate isoliert. Die Strukturaufklärung aller Verbindungen erfolgte in underivatisierter Form durch die Kombination von 1D- und 2D- NMR Spektroskopie, Circular Dichroismus (CD) sowie massenspekrometrische Methoden und führte zur Identifizierung von 4',3"-Di-O-methylapocynin-B (1), 4',3"-Di-O-methylapocynin-D (2), Epigallocatechin-3-O-ferulat (3), 4'-O-Methylepigallocatechin-3-O-ferulat (4), 4'-O-Methylepigallocatechin-3-O-gallat (5), 4'-O-Methylepicatechin-3-O-gallat (6), Epicatechin-3-O-gallat (7), Epigallocatechin-3-O-gallat (8), 3'-O-Methylepicatechin (9), 4'-O-Methylepigallocatechin (10), 4'-O-Methylgallocatechin (11), Epigallocatechin-(4beta-8)-4'-O-methylgallocatechin (12), Epicatechin-(4beta-8)-4'-O-methylgallocatechin (13), 4'-O-Methylgallocatechin-(4alfa-8)-4'-O-methylgallocatechin (14) und Epigallocatechin-(4beta-8)-epigallocatechin-3-O-gallat (15). Interessanterweise waren fast alle Verbindungen methyliert, was bisher selten beobachtet wurde. Die Verbindungen 1 - 6 und 12 - 14 wurden erstmals als Sekundärmetabolite beschrieben. Mit den Dimeren 12 - 15 wurden Konformationsanalysen mittels Computer- Modelling unter Verwendung von MM+-Berechnungen durchgeführt. Die so erhaltenen verschiedenen Konformations-Möglichkeiten der heterocyclischen Ringe und die Rotation um die Bindung zwischen den beiden Monomeren wurden mit den gemessenen NMR-Daten verglichen. In allen Fällen wurde für den heterocyclischen C-Ring bevorzugt eine Konformation zwischen einem C(2)-Sofa und einem Halb-Sessel und für den F-Ring ein Halb-Sessel beobachtet, wobei die Ringe B und E eine quasi-equatoriale Orientierung einnahmen. Die Dimere 12, 13 und 15 mit einer 4R-Konfiguration (= beta) wiesen bevorzugt eine kompakte Konformation auf. Verbindung 14 mit einer 4S-Konfiguration (= alfa) lag sowohl in der kompakten als auch in der ausgestreckten Konformation vor.
Mit Hilfe einer HPLC-UV-Methode und einer RP-18-Säule wurden die meisten der isolierten Verbindungen im Extrakt quantifiziert, wobei 4'-O-Methylgallocatechin (11) die Hauptkomponente darstellte.
Der Extrakt und die isolierten Verbindungen wurden hingehend ihrer wundheilenden Eigenschaften in einem Scratch- Assay mit Maus- Fibroblasten untersucht. Der Extrakt erhöhte signifikant die Einwanderung und Proliferation der Zellen bei einer Konzentration von 10 mikrogram/ml, während höhere Konzentrationen die Zellzahl, wahrscheinlich aufgrund zytotoxischer Effekte, erniedrigten. Die isolierten Verbindungen zeigten im Allgemeinen einen stimulierenden Effekt bei Konzentrationen von 1 – 10 mikromolar, wobei die Verbindungen 5, 6 und 7 mit einem Galloylring am aktivsten waren. Da der Transkriptionsfaktor NF-kB und die Kinase p38 MAPK eine zentrale Rolle in inflammatorischen Signalwegen spielen, wurden der Extrakt und einige der isolierten Verbindungen auf die Beeinflussung dieser Proteine hin untersucht. Im NF-kB EMSA zeigten die Verbindungen 1 (4',3"-Di-O-methylapocynin-B) und 3 (Epigallocatechin-3-O-ferulat) die höchste hemmende Aktivität bei Konzentrationen von 10 und 20 mikromolar. Eine mittlere konzentrationsabhängige hemmende Aktivität auf NF-kB wurde in den anderen Fällen beobachtet. Bei diesen Konzentrationen traten keine zytotoxischen Effekte auf. p38 MAPK wurde von den Verbindungen 7 (Epicatechin-3-O-gallat) und 8 (Epigallocatechin-3-O-gallat) am stärksten gehemmt. Die moderaten hemmenden Effekte auf NF-kB und p38 MAPK könnten sich positiv in der Initiationsphase des Wundheilungsprozesses auswirken und auch die entzündungenhemmenden Eigenschaften bei der Behandlung von Hauterkrankungen erklären. Insgesamt können die erhaltenen Ergebnisse dazu beitragen, die wundheilenden und entzündungshemmenden Eigenschaften von Zubereitungen aus der Rinde von P. rigida zu erklären, wobei Catechinderivate als aktivste Verbindungen für diese Effekte verantwortlich sind. Letztlich aber sollten in vivo-Untersuchungen für endgültige Schlußfolgerungen durchgeführt werden.


SWD-Schlagwörter: Magnetische Kernresonanz , Biologische Aktivität , JURKAT-Zelle , Fibroblast , Pflanzeninhaltsstoff , Wundheilung , Entzündung , Parapiptadenia rigida
Freie Schlagwörter (englisch): Parapiptadenia rigida , wound healing , catechins , NMR , fibroblast
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Merfort, Irmgard (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 17.03.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 23.03.2011
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