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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-80789
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8078/


Cebo, Daniel

Site-directed mutagenesis as a tool for functional characterization of the Ammonium Transport Protein Amt-1 from Archaeoglobus fulgidus

Ortsspezifische Mutagenese als ein Werkzeug für die funktionelle Charakterisierung des Ammoniumtransportproteins Amt-1 aus Archaeoglobus fulgidus

Dokument1.pdf (2.093 KB) (md5sum: f1204742a0f871af07905efc4fd282c5)

Kurzfassung in Englisch

Ammonium transport proteins (Amt) form highly conserved family of integral membrane
proteins present in all domains of life. Functional studies with members of this family have yielded controversial results with respect to the chemical identity of the transported species (NH4 or NH3) as well as to the classification of the proteins as channels or secondary active transporters. Presently, four Amt structures were solved at high resolution: the AmtB from the eubacteria E. coli (Stroud et al. Science, 2004, 305:1587 – 1594), the Amt-1 from the hyperthermophilic archaeon Archaeoglobus fulgidus (Andrade et. al. PNAS, 2005, 102(42):14994-9), the Rh50 from Nitrosomonas europea (Winkler et al. PNAS, 104(49): 19303–19308; Chan et al. PNAS, 2007, 104: 19279-19284) and the human Rhesus glycoprotein RhCG (Stroud et. al. 2010, PNAS, 21: 9638).

All proteins share a remarkable degree of structural homology with 11 transmembrane helices per monomer. A narrow, non-continuous and mainly hydrophobic pore, located at the center of each monomer of the trimeric Amt-1, is thought to be the substrate channel. At the extracellular channel cleft, ammonium selectivity and recruitment presumably occurs via a cation-pi interaction with the side chain of W137 stabilized by hydrogen bonds to the sid chain of S208. Below, F96 and F204 block the channel continuity. Further into the hydrophobic pore leading to the cytoplasm, the side chains of two highly conserved histidine residues (H157 and H305) are bridged by an H-bond and lie adjacent, with their edges pointing into the cavity. The role of these histidine residues is not yet understood.

To understand the transport mechanism of Amt proteins in general, we are using the Af-Amt-1 as a model. By combining site-directed mutagenesis and biochemical, biophysical and crystallographic methods we are investigating the validation of the recruitment site as such, the possibility of ammonium deprotonation and reprotonation events, the substrate ionic form or the role of the C-terminus in transport as well as its function in the interaction with regulatory proteins.


Kurzfassung in Deutsch

Ammoniumtransportproteine (Amt) bilden eine hochkonservierte Familie von integralen Membranproteinen, die in allen Domänen des Lebens zu finden sind. Funktionelle Studien mit Mitgliedern dieser Familie führten zu kontroversen Ergebnissen sowohl betreffend der chemischen Zuordnung der von ihnen transportierten Spezien (NH4 or NH3) als auch der Klassifizierung dieser Proteine als Kanäle oder sekundäre aktive Transporter.
Bisher wurden vier Amt-Strukturen mit hoher Auflösung gelöst: AmtB des Eubakteriums E. coli (Stroud et al. Science, 2004, no. 305, pp. 1587-1594), Amt-1 aus dem hyperthermophilen Archaeon Archaeoglobus fulgidus (Andrade et. al. PNAS, 2005, 102(42):14994-9), Rh50 aus Nitrosomonas europea (Winkler et al. PNAS, 104(49): 19303–19308; Chan et al. PNAS, 2007, 104: 19279-19284) und das humane Rhesus Glykoprotein RhCG (Stroud et. al. 2010, PNAS, 21: 9638).

Alle Proteine weisen eine bemerkenswert hohe strukturelle Homologie mit 11 transmembranen Helizes pro Monomer auf. Eine schmale, nicht durchgängige und hauptsächlich hydrophobe Pore lokalisiert im Zentrum eines jeden Monomers des trimeren Amt-1 wird als Substratkanal vermutet. Die Selektierung und Rekrutierung von Ammonium findet wahrscheinlich am extrazellulären Kanalausgang aufgrund von Kation-pi Interaktion statt, stabilisiert durch Wasserstoffbrücken zwischen den Seitenketten von W137 und S208. Ein weiterer Fortlauf des Kanals wird durch F96 and F204 blockiert. Weiter im Inneren der hydrophoben Pore in Richtung Zytoplasma werden die Seitenketten von zwei hochkonservierten an den Hohlraum grenzende Histidinreste (H157 and H305) durch Wasserstoffbrücken miteinander verbunden. Die Rolle dieser Histidinreste ist bisher noch unbekannt.

Um den Transportmechanismus der Amt-Proteine generell zu verstehen, wurde Af-Amt-1 als Model verwendet. Durch Kombination von Ortspezifische Mutagenese und biochemischer, biophysikalischer und kristallographischer Methoden sollte die Validierung eines solchen Rekrutierungsortes selbst, die Möglichkeit von Ammoniumdeprotonierung- und Reprotonierungsvorgängen als auch die ionische Form des Substrats sowie die Rolle des C-Terminus beim Transport und dessen Funktion in der Interaktion mit regulatorischen Proteinen wie GlnK untersucht werden.


SWD-Schlagwörter: Ortspezifische Mutagenese
Freie Schlagwörter (deutsch): Ortspezifische Mutagenese , Bakteriellen Zellen Knockout , Ammoniumtransportproteins , Protein Kristallstrukturanalyse , Neßler-Reaktion
Freie Schlagwörter (englisch): Site-directed mutagenesis , Bacterial knockout cells , Ammonium transport proteins , Protein crystallography , Nessler reaction
Institut: Institut für Organische Chemie und Biochemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Andrade, Susana (PD Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.09.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 04.05.2011
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