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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-81164
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8116/


Grieshaber, Philippe

Protektion retinaler Ganglienzellen in vivo mit dem Histondeacetylaseinhibitor Valproinsäure

Valproic-acid-mediated protection of retinal ganglion cells in vivo

Dokument1.pdf (64.794 KB) (md5sum: 2fcec1d5cfb140168fc01b1cce79a26e)

Kurzfassung in Deutsch

Protektion retinaler Ganglienzellen mit Valproinsäure
Die transkriptionelle Aktivität des Chromatins wird u.a. über epigenetische Mechanismen wie die Acetylierung von Histonproteinen moduliert. Gesteigerte Acetylierung führt zu vermehrter Transkription. Neurodegeneration geht mit einer initialen Verschiebung der Histonacetylierungshomeostase (HAH) in Richtung Deacetylierung einher. Dies führt über sogenannte „transkriptionelle Dysfunktion“ zum Einsetzen apoptotischer Degeneration der betroffenen Neurone. Histondeacetylaseinhibitoren (HDACi) verschieben die HAH in Richtung Acetylierung. Es wurde gezeigt, dass Valproinsäure (VPA), ein HDACi, protektive Effekte auf degenerierende zentrale Neurone hat. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob VPA nach akuter Sehnervquetschung (optic nerve crush: ONC) die Degeneration retinaler Ganglienzellen (RGZ) verzögert und die RGZ-Regeneration fördert. Weiterhin wurden potentielle molekulare Mechanismen der VPA-vermittelten Neuroprotektion untersucht.
Die RGZ adulter Ratten wurden nach retrogradem Färben durch unilateralen ONC links geschädigt. Die rechten Augen dienten als Kontrollen. Die Tiere wurden ab dem präoperativen Tag bis zur Tötung mit VPA (300 mg/kg) oder Ringer-Lösung (RL) 12-stündlich subkutan behandelt. Außerdem wurde die einmalige, postläsionale intravitreale (ivt-) Applikation von VPA evaluiert. Fünf bzw. 8 Tage nach ONC erfolgte die Tötung der Tiere und die Explantation der Netzhäute. Am Flachpräparat erfolgte die Quantifizierung vitaler RGZ. Unter systemischer und ivt- VPA-Behandlung zeigte sich 5 bzw. 8 Tage nach ONC eine signifikant höhere RGZ-Dichte als nach RL-Behandlung. Der Einfluss von VPA auf das Regenerationspotential der RGZ wurde in retinalen Kulturen untersucht. Hier zeigte sich unter VPA-Behandlung eine signifikant gesteigerte Axonaussprossung im Vergleich zur RL-Gruppe. In retinalen Proteinextrakten wurde die Aktivität des apoptotischen Schlüsselenzyms Caspase-3 gemessen. Diese war an Tag 5 nach ONC durch VPA im Vergleich zur RL-Gruppe signifikant vermindert. Mittels Western Blot und ELISA wurde die Menge acetylierter Histonproteine 3 und 4 (H3 und H4) untersucht. Hier zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen VPA- und RL-Gruppe. Ein bzw. 2 Tage nach ONC wurde die Aktivität des ERK- (extracellular signal-regulated-) Signalwegs untersucht. Es zeigte sich eine verlängerte Aktivierung dieses Signalwegs durch VPA.
Zusammenfassend zeigte VPA eine neuroprotektive Wirkung auf akut geschädigte RGZ. VPA verzögerte die apoptotische Degeneration und steigerte die das Regenerationspotential der RGZ. Eine vermehrte Histonacetylierung durch VPA wurde im Rahmen dieser Untersuchung in RGZ nicht nachgewiesen. VPA, ein weitläufig zur Epilepsie-Behandlung eingesetzter Wirkstoff könnte in Zukunft eine neuroprotektive Therapieoption für neurodegenerative Erkrankungen des Sehnervs darstellen.

Vitalfärbung am retinalen Flachpräparat mit Calcein-AM: Eine neue Methode zur Quantifizierung retinaler Ganglienzellen
Die RGZ-Dichte wird oft als Parameter zur Quantfizierung von Neuroprotektion und Neurodegeneration verwendet. Der Goldstandard zur selektiven RGZ-Färbung ist das retrograde Färben (RF) mit einem Fluoreszenzfarbstoff, z.B. Fluorogold (FG). Das RF unterscheidet jedoch nicht zwischen vitalen und abgestorbenen RGZ. Diese erscheinen solange FG-positiv, bis sie mit einer Latenz von ca. 5 Tagen von aktivierten Mikrogliazellen (AMZ) phagozytiert werden. Um das RF um Informationen über die Vitalität der RGZ zu ergänzen, wurde in dieser Arbeit die zusätzliche Vitalfärbung mit Calcein-AM (CAM) an retinalen Flachpräparaten etabliert und validiert.
Hierzu wurden nach RF die linken Sehnerven adulter Ratten durch ONC geschädigt. Zwei, 5, 8 bzw. 11 Tage nach ONC wurden retinale Flachpräparate hergestellt und diese mit CAM angefärbt. Die Auswertung von 12 definierten Arealen pro Netzhaut erfolgte zweifach: durch den jeweiligen Fluoreszenzfilter wurden die FG-Färbung und die CAM-Färbung getrennt erfasst und ausgewertet. Durch halbtransparente Überlagerung entsprechender Areale wurden kolokalisierte zweifach positive Zellen als vitale RGZ gewertet.
Es zeigte sich hierbei, dass durch die Kombination aus FG- und CAM-Färbung vitale RGZ identifiziert werden. Die Dichte vitaler RGZ wurde bereits an Tag 2 nach ONC detektiert und zeigte eine lineare Absterbekinetik.


Kurzfassung in Englisch

Valproic acid (VPA) has been demonstrated to have neuroprotective effects in neurodegenerative conditions. VPA inhibits histone-deacetylases (HDAC) and delays apoptosis in degenerating neurons. The authors investigated whether VPA delays retinal ganglion cell (RGC) death and enhances axonal regeneration after optic nerve crush (ONC). Furthermore, potential molecular targets involved in VPA-mediated protection were analyzed.
METHODS: ONC was performed on the left eye of rats, which received VPA or Ringer's solution subcutaneously (SC; 300 mg/kg twice daily) or intravitreally (single postlesional injection). Densities of fluorogold-labeled RGC were analyzed in retinal flatmounts after 5 or 8 days. Retinal tissue was also harvested and processed to quantify axon growth in retinal explants; evaluate caspase-3 activity; analyze transcription factor cAMP response element binding protein (CREB); and determine acetylated histone 3 and 4, as well as phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (pERK) 1/2.
RESULTS: Five and 8 days after ONC, 93% and 58% RGC survived after subcutaneous VPA treatment in comparison to Ringer's solution (62% and 37% viable RGC), respectively (P < 0.001). Likewise, a single intravitreal injection of VPA immediately after injury significantly delayed apoptosis in RGC (P = 0.0016). Injured RGC treated with VPA showed better regeneration of their axons in culture (196 axons/explant) than the crushed controls receiving Ringer (115 axons/explant). RGC axons of the right control eyes regenerated more after VPA treatment. VPA-mediated neuroprotection and neuroregeneration were accompanied by decreased caspase-3 activity, CREB induction, pERK1/2 activation, but not by altered histone-acetylation.
CONCLUSIONS: VPA provided neuroprotection and axonal regrowth after ONC. Alterations were observed in several pathways; however, the precise mechanism of VPA-mediated protection is not yet fully understood.

Additional Project: Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality.
The number of retinal ganglion cells (RGC) is often used as an outcome measure in neuroprotection. The gold standard for staining RGC is retrograde labeling, e.g. with fluorogold (FG). However, this method alone does not permit to differentiate between viable and dead cells, because dying cells only avoid being counted once they have undergone complete microglial-phagocytosis. To differentiate between viable and dead but still existent RGC, we additionally stained FG-labeled RGC with calcein-acetoxymethylester (CAM).
METHODS: The left optic nerves of rats were crushed 6 days after stereotactical injection of FG into both superior colliculi. The right eyes served as controls. Retinal whole mounts were prepared 2, 5, 8 or 11 days after optic nerve crush (ONC), and incubated for 30min in culture media containing 0.01% CAM. RGC densities were determined in defined areas at different eccentricities under a fluorescence microscope using the appropriate filters. Twice-positive RGC were counted after merging both filters.
RESULTS: The loss of RGC induced by ONC is identified earlier when these cells are detected by FG+CAM rather than by FG-labeling alone. The percentages of FG-positive RGC stained with CAM were 83% in controls, 68% on day 2, 48% on day 5, 26% on day 8, and 9% on day 11 after ONC. The decay rate of FG-prelabeled RGC appears accelerated and becomes more linear when only viable RGC positive for CAM are counted.
CONCLUSIONS: The staining of FG-prelabeled RGC with CAM permits the discrimination between dead and viable RGC in retinal whole mounts, which enables to quantify RGC degeneration earlier after injury than by using microglial-phagocytosis-dependant retrograde labeling alone.


SWD-Schlagwörter: Netzhaut , Valproinsäure , Protektion
Freie Schlagwörter (deutsch): Valproinsäure , Neuroprotektion , retinale Ganglienzellen , Epigenetik
Freie Schlagwörter (englisch): Valproic acid , neuroprotection , retinal ganglion cells , epegentics
Institut: Univ.-Augenklinik
Fakultät: Medizinische Fakultät / Universitätsklinikum
DDC-Sachgruppe: Medizin und Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Lagrèze, Wolf Alexander (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.06.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 16.06.2011
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