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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-81234
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8123/


Pediaditakis, Miriam

Investigations on behaviour and specific localization of DNA repair proteins in Bacillus subtilis

Untersuchungen zu Verhalten und spezifischer Lokalisation von DNA Reparatur Proteinen in Bacillus subtilis

Dokument1.pdf (3.495 KB) (md5sum: a702c114542522726aed832be6863961)

Kurzfassung in Deutsch

Die Erhaltung der genetischen Information und eine fehlerfreie DNA Replikation sind Grundvoraussetzungen, um das Überleben aller Organismen sicherzustellen. Eine besondere Bedrohung für die Integrität des Genoms sind Doppelstrangbrüche (DSB) und Doppelstrang-Quervernetzungen, die durch energiereiche Strahlung oder verschiedene Chemikalien hervorgerufen werden und dabei genetische Information verändern oder zerstören. Um dies zu verhindern, haben Eukaryoten und Prokaryoten individuelle Reparaturmechanismen entwickelt, an denen zahlreiche Proteine beteiligt sind, die an den Bruchstellen Reparaturzentren (RZ) ausbilden. Eine der Hauptstrategien ist die homologe Rekombinationsreparatur (HR), die die beschädigte DNA Region unter Verwendung einer intakten Chromosomenkopie als Vorlage repariert. Bacillus subtilis besitzt zwei sich überschneidende HR-Wege, den AddAB- und den RecF-Weg, die verschiedene Proteine mit identischen Funktionen verwenden.
Diese Arbeit befasste sich mit der Untersuchung der zeitlichen und räumlichen Lokalisierung der Proteine RecJ (einzelstrang-spezifische Exonuklease), RecQ und RecS (DNA-Helikasen), die Bestandteil des RecF-Weges sind und dabei die Resektion von DNA-Enden an Bruchstellen katalysieren. Fluoreszenzmikroskopie-Studien (FRAP-, Time Lapse- und Kolokalisationsexperimente) ergaben, dass diese Proteine während der exponentiellen Wachstumsphase mit der Replikationsmaschinerie (Zellmitte) assoziiert vorliegen, von dort aber entlassen werden, sobald DSB eingeführt werden und an vielen Stellen auf dem Chromosom lokalisieren, u.a. an RZ.
Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Charakterisierung eines kleinen Gens namens yisB, dem ebenfalls eine Rolle bei der DNA-Reparatur zugeschrieben wurde. Bemühungen, yisB zu deletieren, blieben erfolglos, und eine yisB-Depletion führte zu massiven Wachstumsstörungen der Zellen und dekondensierter DNA. Demzufolge ist yisB essentiell für die Lebensfähigkeit der Zellen und erfüllt vermutlich eine Funktion während der DNA-Replikation und/oder Segregation. Sequenzanalysen ergaben, dass yisB für eine isoliert stehende HNH-Domäne kodiert, weshalb das Protein ab sofort HlpB (HNH-like protein of Bacillus) genannt wird. HNH-Domänen sind weit verbreitet unter DNA-Bindeproteinen, die an verschiedenen Prozessen wie DNA-Reparatur, Replikation oder Rekombination beteiligt sind. Sequenzvergleiche führten zur Identifizierung homologer Proteine, die zum Teil bereits als Restriktionsendonukleasen identifiziert wurden. In vitro Experimente zeigten, dass HlpB in Abhängigkeit diverser Metallionen an verschiedene DNA-Substrate bindet. Endonuklease-Aktivität konnte jedoch nicht gemessen werden. Interaktionsstudien führten zur Identifizierung zweier potentieller HlpB-Interaktionspartner, die beide an unterbrochenen Replikationsgabeln agieren. Mikroskopische Untersuchungen ergaben, dass HlpB in Folge von DSB ein Lokalisierungsmuster aufweist, welches an das des Replisoms erinnert. Dies stützt die Hypothese, dass HlpB eine essentielle Funktion an unterbrochenen Replikationsgabeln erfüllt.

Des Weiteren wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie Abhängigkeiten bezüglich der Lokalisierung von Proteinen analysiert, die an der HR beteiligt sind. RecF, RecO und RecR katalysieren das Beladen von ssDNA-Regionen mit RecA Rekombinase Protein. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Lokalisierung des RecFOR-Proteinkomplexes von einer recJ-Deletion nicht beeinflusst wird. Umgekehrt sollte gezeigt werden, ob eine recO-Deletion die Lokalisierung von RecJ, RecQ und RecS beeinflusst: eine entsprechende Abhängigkeit konnte jedoch nicht festgestellt werden.
Darüber hinaus wurde untersucht, ob eine Beziehung zwischen einzelnen Rekombina-tionsproteinen und der essentiellen Helikase PcrA besteht, die eine Rolle bei der Replikation bestimmter Plasmide und der UV-Reparatur spielt. Diese Arbeit sollte zeigen, ob RecN, RecO und RecF noch an RZ akkumulieren, wenn PcrA in seiner Funktion beeinträchtigt ist. Die Ergebnisse zeigten, dass PcrA keinen Einfluss auf eine erfolgreiche Lokalisierung von RecN, RecO und RecF an DSB hat und somit vermutlich nicht in die Initialschritte der HR involviert ist. Im Gegensatz dazu ergaben mikroskopische Untersuchungen von DnaX, einer Komponente des Replisoms, in PcrA-defizienten Zellen ein deutlich verändertes Lokalisierungsmuster für DnaX. Anstelle von ein oder zwei Replikationsgabeln, stieg die Zahl pro Zelle signifikant an, was auf eine zusätzliche Funktion von PcrA während der chromosomalen DNA-Replikation hinweist, möglicherweise bei der Reaktivierung von Replikationsgabeln oder der DNA-Synthese.


Kurzfassung in Englisch

Maintenance of the genetic information and accurate DNA replication are basic requirements to ensure survival of all organisms. A major threat for the integrity of the genome are double-strand breaks (DSBs) or interstrand crosslinks caused by high-energy radiation or several chemicals that modify DNA and thereby lead to errors or even loss of information. To prevent this, eukaryotes and prokaryotes have evolved individual repair mechanisms involving large numbers of proteins, which form a repair centre (RC) at the break site. One major strategy to eliminate these DNA lesions is homologous recombination (HR), which uses the intact sister chromosome as template for faithful repair of the damaged region. Bacillus subtilis possesses two overlapping HR pathways, the AddAB and the RecF pathway, which make use of different proteins fulfilling identical functions.
This work investigated the temporal and spatial localization of RecJ (ssDNA-specific exonuclease), RecQ and RecS (DNA helicases), which mediate end-processing of the DNA at ssDNA gaps or DSBs during the RecF pathway. Fluorescence microscopy studies, involving FRAP analyses, co-localization and time lapse and experiments, revealed that these proteins are stably attached to the replication fork (cell centre) during exponential growth phase but are released upon induction of DSBs to act many sites on the chromosome, including RCs.
Another aspect of this work was the characterization of a small gene named yisB, which has been proposed to be also involved in DNA repair. Efforts to delete the yisB gene were without success, and yisB depletion lead to severe growth defects and decondensed nucleoids, indicating that yisB is essential for cell viability and might mediate an important step during DNA replication and/or segregation. Sequence analysis revealed that yisB encodes a stand-alone HNH domain, wherefore we named the protein HlpB (HNH-like protein of Bacillus). HNH domains are widely spread in many DNA binding proteins, which are involved in various DNA-related processes. Sequence alignments lead to the identification of many HlpB homologues, which have been partly identified as restriction endonucleases. In vitro assays revealed that HlpB binds to different DNA substrates in the presence of metal ions, but no evidence could be found that HlpB also features endonuclease activity. Interaction studies lead to the identification of two potential interaction partners, which are known to act at stalled replication forks. Visualization of HlpB in cells containing DSBs revealed that HlpB localizes in a pattern, which is reminiscent of patterns found for components of the replication machinery, supporting the idea that HlpB might act at stalled replication forks.
Finally, localization dependencies among proteins involved in HR have been investigated via fluorescence microscopy analyses by using several deletion mutants. RecF, RecO and RecR catalyze loading of RecA recombinase onto ssDNA regions during HR. This work revealed that RecFOR complex is able to localize properly in ΔrecJ cells. Accordingly, RecFOR localization at RCs does not necessarily require RecJ. Vice versa, a recO deletion does not seem to influence focus formation of the end-processing enzymes RecJ, RecQ and RecS during vegetative growth or after induction of DSBs.
Furthermore, this work tried to find a relation between early stage recombination proteins and the essential DNA helicase PcrA, which is known to play a role in rolling-circle replication of certain plasmids and UV repair. This work should unveil if RecN, RecO and RecF accumulation at RCs is affected in PcrA-deficient cells. However, PcrA did not seem to have an influence on early steps of HR since RecN, RecO and RecF were all capable of forming discrete foci on the nucleoid. However, visualization of DnaX, a part of the replication fork, in pcrA-deficient cells showed a significant change of the DnaX localization pattern. Instead of one or two replication forks, forks accumulated on the nucleoid, suggesting that PcrA helicase plays an additional role in chromosomal DNA replication, probably in reactivation of stalled replication forks or DNA synthesis.


SWD-Schlagwörter: Homologe Rekombinationsreparatur (HR) , Doppelstrangbrüche (DSB) , Reparaturproteine , Reparaturzentrum (RZ) , Fluoreszenzmikroskopie
Freie Schlagwörter (englisch): Homologous recombination (HR) , Double-strand breaks (DSBs) , Repair proteins , Repair centre (RC) , Fluorescence microscopy
Institut: Institut für Biologie 2
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Graumann, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.05.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 15.06.2011
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