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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-81258
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8125/


Bauer, Theresa

Investigation of pLS20 mediated conjugative DNA transfer in the Gram positive bacterium Bacillus subtilis

Untersuchung des pLS20 vermittelten, konjugativen DNA-Transfers in Bacillus subtilis

Dokument1.pdf (2.883 KB) (md5sum: ca79a4d63ed2f40abc39e1f22cd4429b)

Kurzfassung in Englisch

Conjugation is one of the most important mechanisms in microbial evolution that leads to an efficient uptake and distribution of novel genetic material. Direct cell/cell contact facilitates the transfer of genetic material from a donor to a recipient cell. Afterwards, the DNA can be integrated into the host chromosome, or be inherited as a self replicating element. Since this leads to a rapid spreading of antibiotic resistances and virulence factors, it is also a clinically relevant problem.
Although the DNA transfer via conjugation was described for the Gram negative bacterium E. coli already in 1946 from J. Lederberg und E. Tatum, the molecular mechanism of transfer remain to be solved. For the plant pathogenic Gram negative bacterium Agrobacterium tumefaciens some mechanism of regulation and parts of transfer actions were elucidated. Nevertheless many key questions concerning the identification of all involved proteins, their detailed functions and interactions as well as their regulation remain to be addressed. Especially little is known about the conjugative DNA transfer systems in Gram positive bacteria, although this group of bacteria contains many important human pathogens.
In this work, I have analysed conjugative DNA transfer in the Gram positive bacterium Bacillus subtilis, which is mediated by the plasmid pLS20. Information about growth phase dependent transfer kinetic of strains harbouring the plasmid were already available.
Through detailed sequence analysis of open reading frames on pLS20, 6 proteins were identified, which are probably involved in conjugation. The in vivo localisation of these proteins was investigated by fluorescence microscopy. Combining data about transfer kinetics and biochemical analysis, showing conserved properties to homologous proteins from other systems, a model for DNA transfer was proposed, describing temporal and spatial regulation of this process.
Initially, proteins that were uniformly distributed within the cytosol started to localise after a short incubation in fresh medium preferentially to the cell pole, but also to the lateral sides of the membrane. The localisation of proteins in lag phase cells correlated to DNA transfer ability and efficiency, proved by kinetic studies. The plasmid itself was also stably localised to the cell pole and the membrane, as revealed by TIRF microscopy. It was possible to show that cells, which had started an active cell cycle, did not show localisation of the proposed conjugation proteins, although these were still expressed.
Thus, the ability to transfer DNA via conjugation seems to be mediated by the assembly of the conjugation machinery, preferentially at the cell pole. After the transition of cells to active growth the machinery disassembles and the bacterial population rapidly loses the ability to conjugate.
The visualised conjugation proteins usually colocalised, but also showed somewhat different localisation patterns, suggesting that the machinery is composed of different modules of cytosolic and membrane-integral proteins that interact with each other to set up a large functional DNA transfer apparatus.


Kurzfassung in Deutsch

Konjugation ist einer der wichtigsten Mechanismen in der bakteriellen Evolution und führt zu einer effizienten Aufnahme und Verbreitung von neuem genetischem Material. Durch direkten Zellkontakt wird die DNA-Übertragung von einer Donor- in eine Rezipientenzelle ermöglicht. Die DNA kann anschließend über homologe Rekombination in das Wirts-Chromosom integrieren, oder als selbstständig replizierendes Element weiter vererbt werden. Dies führt unter anderem zur schnellen Verbreitung von Resistenzgenen und Virulenzfaktoren und ist somit auch ein medizinisch und klinisch relevantes Problem.
Obwohl der Vorgang der DNA-Übertragung im Gram-negativen Bakterium E. coli bereits 1946 von J. Lederberg und E. Tatum entdeckt und beschrieben wurde, ist der molekulare Mechanismus nicht geklärt. Im Gram-negativen, pflanzenpathogenen Organismus Agrobacterium tumefaciens sind bereits einige Regulationsmechanismen erforscht und Teilabläufe des Transfers aufgeklärt worden. Dennoch fehlen viele Informationen bezüglich aller an der DNA-Übertragung beteiligten Proteine, ihrer genauen Funktionen und Interaktionen sowie der Regulation der Konjugation. Speziell die konjugativen DNA-Übertragungssysteme in Gram-positiven Bakterien sind bisher kaum erforscht, obwohl diese Gruppe viele wichtige humanpathogene Bakterien mit einschließt.
In der vorliegenden Arbeit wird der konjugative DNA-Transfer im Gram-positiven Bakterium Bacillus subtilis untersucht. Vermittelt wird diese Fähigkeit durch das Plasmid pLS20, von dem bereits eine wachstumsphasenabhängige Transferkinetik bekannt ist.
Durch detaillierte Sequenzanalysen der offenen Leseraster des Plasmids wurden 6 Proteine identifiziert, die in den konjugativen Prozess involviert sein könnten. Die in vivo Lokalisation dieser Proteine wurde fluoreszenzmikroskopisch durchgeführt. Zusammen mit Daten zur Kinetik des DNA-Transfers und biochemischen Analysen, die konservierte Eigenschaften zu homologen Proteinen aufzeigten, konnte ein Modell entwickelt werden, das die zeitliche und räumliche Regulation des pLS20 vermittelten DNA-Transfers beschreibt:
Zu Beginn im Cytosol gleichmäßig delokalisierte Konjugationsproteine lokalisierten nach kurzer Zeit der Inkubation in frischem Medium hauptsächlich an einem Zellpol, aber auch an den lateralen Seiten der Membran. Die Lokalisation der Proteine in der lag-Phase des Zellwachstums korrelierte mit der wachstumsphasenabhängigen Fähigkeit und Effizienz des konjugativen DNA-Transfers. Das Plasmid konnte mit Hilfe von TIRF-Mikroskopie ebenfalls bevorzugt an der Membran und dem Pol lokalisiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass in Zellen, die den aktiven Zellzyklus gestartet hatten, Konjugationsproteine nicht mehr lokalisierten, obwohl sie weiterhin in gleichen Mengen exprimiert wurden. Dies lässt darauf schließen, dass die Fähigkeit zur Konjugation von Proteinen vermittelt wird, die wachstumsphasenabhängig zu einer Maschinerie assemblieren, die bevorzugt am Zellpol lokalisiert. Zu Beginn des aktiven Zellwachstums und der Replikation zerfällt der Membrankomplex und die Fähigkeit zur Konjugation geht verloren.
Die Konjugationsproteine zeigten meist Colokalisation, aber es wurden auch abweichende Lokalisationsmuster beobachtet, was darauf hinweist, dass die Maschinerie aus verschiedenen cytosolisch- und Membran-lokalisierten Modulen bestehen könnte, die zusammen durch Interaktionen eine funktionale DNA-Transfer Maschinerie bilden.


SWD-Schlagwörter: Bakterielle Konjugation
Freie Schlagwörter (deutsch): DNA-Transfer , Bacillus subtilis , pLS20
Freie Schlagwörter (englisch): conjugation , DNA transfer , Bacillus subtilis , pLS20
Institut: Institut für Biologie 2
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Graumann, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 15.06.2011
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