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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-81271
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8127/


Dörner, Katerina Henrike

Der Elektronentransfer der Escherichia coli NADH:Ubichinon Oxidoreduktase sowie die ESR-spektroskopische Charakterisierung weiterer Metalloproteine

Electron transfer in Escherichia coli NADH:ubiquinone oxidoreductase and EPR-spectroscopic characterization of metalloproteins

Dokument1.pdf (2.514 KB) (md5sum: b7d17baa94af2c3727c6315cec3105e2)

Kurzfassung in Deutsch

Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, auch respiratorischer Komplex I genannt, ist ein energiewandelnder Enzymkomplex der Atmungskette. Der Komplex I koppelt den Elektronentransfer von NADH auf Ubichinon mit einer Protonentranslokation über die Cytoplasmamembran in Prokaryoten und die innere Membran der Mitochondrien in Eukaryoten. Der Komplex I aus Escherichia coli setzt sich aus 13 Untereinheiten zusammen und ist aus einem in der Membran eingebetteten, hydrophoben Arm und einem ins Cytoplasma ragenden, peripheren Arm aufgebaut. Alle bisher bekannten Kofaktoren, ein Flavinmononukleotid (FMN) und die neun Eisen-Schwefel (Fe-S)-Zentren N1a, N1b, N2, N3, N4, N5, N6a, N6b und N7, liegen im peripheren Arm. Sieben der neun Fe-S-Zentren bilden eine Elektronentransportkette zwischen dem FMN, das die Elektronen vom NADH aufnimmt, und dem Elektronenakzeptor Ubichinon. Das zweikernige Fe-S-Zentrum N1a ist aufgrund seiner Lage im Komplex nicht Teil der Elektronentransportkette. Es kann Elektronen ausschließlich vom FMN aufnehmen und wird durch NADH reduziert. Seine Funktion im Komplex I ist bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurde durch Mutagenesestudien gezeigt, dass N1a essentiell für die Stabilität des Komplex I ist. Der Austausch der Cysteine des Bindemotivs von N1a gegen Alanine oder Serine führte jeweils zu einem instabilen Komplex I.

Der Elektronentransfer innerhalb des E. coli Komplex I war das zentrale Thema dieser Arbeit. Mittels der Microsecond-Hyperquenching Technik und Tieftemperatur ESR-Spektroskopie wurde die Reduktion der einzelnen Fe-S-Zentren während der Reaktion des Komplex I mit NADH in einem Zeitfenster von 100 µs bis 6 ms verfolgt. Ein Apparatur-bedingtes Artefakt im spektralen Bereich der vierkernigen Fe-S-Zentren lässt nur die detaillierte Analyse der Reduktionskinetik der zweikernigen Fe-S-Zentren N1a und N1b zu. Die Ergebnisse zeigen, das N1a an der physiologischen Reaktion des Komplex I beteiligt ist. Sie unterstützen die Vermutung, dass N1a durch die zeitweilige Aufnahme eines Elektrons eine mögliche Radikalbildung am FMN vermindert und somit zum Schutz des Organismus vor gefährlichen Radikalen beiträgt. Die Vermutung, dass das erste Elektron vom FMN über die Elektronentransportkette auf das nahe der Ubichinonbindestelle gelegene N2 und das zweite Elektron auf N1a übertragen wird, wurde in dieser Arbeit unterstützt.

Desweiteren sollte die Beteiligung aromatischer Aminosäuren am Elektronentransfer im Komplex I untersucht werden. Ist der Abstand zwischen zwei Redoxzentren kleiner als 14 Å, wird eine direkte Elektronenübertragung mit ausreichend hohen Transferraten angenommen. Bei größeren Abständen sind nach der hopping Theorie aromatische Aminosäuren direkt am Elektronentransfer beteiligt. Im Komplex I liegen die Fe-S-Zentren N5 und N6a mehr als 14 Å voneinander entfernt und sind auf zwei verschiedenen Modulen lokalisiert, aus denen der Komplex I evolutionär entstanden ist. Die hopping-Theorie schlägt drei konservierte, aromatische Aminosäuren vor, die an diesem Transferschritt beteiligt sein können. In dieser Arbeit wurden die konservierten, aromatischen Aminosäuren im E. coli Komplex I gegen Leucin und gegen die jeweils anderen aromatischen Aminosäuren ausgetauscht. Der Einfluss dieses Austausches auf die Aktivität des Komplex I wurde bestimmt. Die Ergebnisse unterstützen die hopping Theorie und lassen die Beteiligung aromatischer Aminosäuren an dem Transferschritt zwischen N5 und N6a vermuten. Weitere konservierte, aromatische Aminosäuren, die am Elektronentransfer zwischen Fe-S-Zentren mit Abständen kleiner als 14 Å beteiligt sein sollen, wurden in dieser Arbeit ausgetauscht. Eine Beteiligung am Elektronentransfer konnte aber experimentell nicht bestätigt werden.

Zwei weitere Metalloproteine wurden in der vorliegenden Arbeit ESR-spektroskopisch charakterisiert. Das Protein MM0632 aus Methanosarcina mazei wird als Prototyp einer neuen Klasse von Superoxid Reduktasen, die in anaeroben Organismen am Abbau von reaktiven Sauersoffspezies beteiligt sind, vorgeschlagen. Durch ESR-Spektroskopie wurden neben einem für die Enzymfamilie typischen [Fe(His)4(Cys)]-Zentrum erstmalig ein vierkerniges Fe-S-Zentrum in einer Superoxid Reduktase nachgewiesen. Das Fragment BamBC aus dem Proteinkomplex BamB-I aus Geobacter metallireducens ist ein Vertreter einer neuen Klasse von Benzyl-CoA Reduktasen, die in anaeroben Organismen am Abbau von aromatischen Verbindungen beteiligt sind. Durch ESR-Spektroskopie wurden in dieser Arbeit neben einem Wolfram-Kofaktor ein dreikerniges und drei vierkernige Fe-S-Zentren nachgewiesen.


Kurzfassung in Englisch

The NADH:ubiquinone oxidoreductase, also named complex I, is the entry point of electrons into the respiratory chain of eukaryotes and many bacteria. It couples the electron transfer from NADH to ubiquinone with the translocation of protons across the membrane. The enzyme has a L-shaped over-all conformation, with a hydrophilic arm and a hydrophobic arm embedded in the membrane. The hydrophilic part contains all known cofactors, one flavinmononucleotide (FMN) and nine iron-sulfur-(Fe-S-)clusters named N1a, N1b, N2, N3, N4, N5, N6a, N6b and N7. Seven Fe-S-clusters form an electron transfer path between the FMN at the NADH binding site and the electron acceptor ubiquinone. Because of its location the binuclear Fe-S-cluster N1a is not part of the electron transfer chain and its function is still unknown. In this work mutation studies demonstrated that N1a is essential for the stability of complex I from Escherichia coli. Substitution of N1a coordinating cysteines by alanine or serine led to an unstable complex I.

The electron transfer within complex I from E. coli was the main topic of this work. The reduction of the individual Fe-S-clusters was observed on a microsecond time scale using the microsecond freeze-hyperquenching technique and low temperature EPR spectroscopy. An artifact caused by the freezing set-up itself only allows a detailed analysis of the binuclear Fe-S-clusters N1a and N1b. The results show that N1a is part of the physiological reaction. In addition the data support the assumption that N1a decreases the production of radicals at the FMN and therefore the production of reactive oxygen species.

Furthermore the role of aromatic amino acids concerning the electron transfer of complex I was investigated in this work. It is generally accepted that electron transfer in proteins takes place via tunnelling, that means through-space electron transfer between redox centers with distances up to 14 Å. Recently it was proposed that conserved aromatic amino acids are directly involved in electron transfer via a hopping mechanism. In complex I the edge-to-edge distance between the Fe-S-clusters N5 and N6a is 14 Å. Three conserved aromatic amino acids were identified by calculation as hopping candidates between these clusters. In this work the three aromatic amino acids in E. coli complex I were substituted with leucine, tryptophan, tyrosine and phenylalanine, respectively. The influence of the substitutions on the activity of complex I was detected. The results support the hopping mechanism and the participation of these amino acids in electron transfer. Further conserved aromatic amino acids in complex I were identified as possibly stepping stones in electron transfer by the hopping theory. These amino acids, which are located between Fe-S-clusters that have edge-to-edge distances of less than 14 Å, were also replaced in the E. coli complex I. A participation in electron transfer could not be confirmed.

Additionally two metalloproteins were characterized by EPR-spectroscopy. The protein MM0632 from Methanosarcina mazei is proposed to be a prototype of a new class of superoxide reductases, which are participating in the degradation of reactive oxygen species in anaerobic organisms. Besides the common [Fe(His)4(Cys)]-center a tetranuclear Fe-S-cluster was detected in a superoxide reductase by EPR-spectroscopy for the first time. The fragment BamBC from the Geobacter metallireducens protein complex BamB-I represents a new class of benzoyl-CoA reductases. These reductases are part of the degradation pathway of aromatic compounds in anaerobic organisms. In addition to a tungsten-cofactor one tri- and two tetranuclear Fe-S-clusters were detected by EPR-spectroscopy.


SWD-Schlagwörter: NADH-Dehydrogenase <Ubichinon> , Elektronentransfer , Elektronenspinresonanzspektroskopie
Freie Schlagwörter (englisch): NADH:ubiquinone oxidoreductase , electron transfer , EPR spectroscopy
Institut: Institut für Organische Chemie und Biochemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Friedrich, Thorsten (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.12.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 10.06.2011
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