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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-81335
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8133/


Biegert, Christine

Vergleich verschiedener In-Vitro-Random-Mutagenese-Methoden zur Generierung einer AcrB-Mutanten-Bibliothek als Basis für ein Screening auf Effluxpumpen-Inhibitor-Resistenz

Comparison of various in vitro random mutagenesis methods for the generation of a AcrB mutants library as basis for a screening of efflux pump inhibitor resistance

Dokument1.pdf (1.193 KB) (md5sum: fb6edf944698c20f04bc315d32b1384f)

Kurzfassung in Deutsch

Die zunehmende Resistenz von Bakterien gegenüber verschiedener Antibiotikaklassen ist in der Klinik zunehmend als ernstes Problem zu werten. Eine wichtige Rolle bei der Resistenzbildung spielt der aktive Transport aus der Zelle, der sogenannte Efflux. Aus diesem Grund ist AcrAB-TolC, eine Multidrug Resistance (MDR)-Effluxpumpe, Forschungsgegenstand vorliegender Arbeit. Aufgrund fehlender Neuentwicklungen von wirksamen Antibiotika stellt die Suche nach Effluxpumpeninhibitoren ein interessantes und aktuelles Untersuchungsgebiet dar. Mit Hilfe einer AcrB-Mutantenbibliothek, die als Basis für ein Screening auf Effluxpumpen-Inhibitor-Resistenz dient, sollen die Grundlagen der Effluxpumpenhemmung erforscht werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei Mutagenesemethoden, zur Herstellung einer Klonbibliothek, getestet. Bei der ersten, sehr einfach durchzuführenden Methode (XL1-Red Competent Cells), wurde der Mutatorstamm XL1-Red zur Mutagenese von AcrB in Plasmid verwendet. Da die Mutationsrate dieser Methode jedoch eindeutig zu niedrig war, konnten keine Klone mit Mutationen in AcrB nachgewiesen werden. Trotzdem zeigten einige Klone eine scheinbare Resistenz. Dieses Phänomen beruht eventuell auf einer Erhöhung der Plasmidzahl und einer somit gesteigerten Effluxaktivität. Die GeneMorphII EZClone Mutagenese empfiehlt sich durch eine gut steuerbare Mutationsrate und beruht auf dem Prinzip der Error-Prone-PCR, bei der AcrB mit Hilfe der DNA Polymerase Mutazyme II mutagenisiert wurde. Mutagenisiertes AcrB wurde als Megaprimer zur Plasmidsynthese verwendet. Klone mit verändertem Phänotyp und Mutationen in AcrB wurden erzeugt. Allerdings zeigte sich auch bei dieser Methode, dass einige Mutanten, möglicherweise durch Erhöhung der Plasmid-Kopienzahl, eine verstärkte Resistenz aufwiesen.
Im Rahmen der GeneMorphII Random Mutagenese in Kombination mit Homologer Rekombination wurde AcrB ebenfalls mittels Mutazyme II Polymerase mutagenisiert. Die Mutagenese-Produkte wurden durch Homologe Rekombination ins Genom eingebracht, wodurch eine Steigerung der Effluxaktivität durch Erhöhung der Plasmidzahl verhindert wird. Mutationsrate und –spektrum zeigten sich wie erwünscht. Somit ist diese Methode am besten geeignet zur Herstellung einer AcrB-Mutanten-Bibliothek.


Kurzfassung in Englisch

The increasing bacterial resistance to antibiotics is a serious problem in clinical work. Thereby the active transport of substances to the cell exterior, the efflux, plays an important role. Because of the absence of new development of effective antibiotics the search of efflux pump inhibitors is an interesting area of research.
In the following study AcrAB-TolC, a Multidrug Resistance (MDR) efflux pump of the gram-negative bacteria species Escherichia coli, was therefore investigated..

The basic principle of efflux pump inhbition was evaluated with the aid of AcrB mutant libraries.
Within the frame of this study three mutagensis methods for the generation of mutant libraries were tested:
1. XL1-Red mutator stain
2. Error- prone PCR
3. Error- prone PCR in combination with homologous recombination


SWD-Schlagwörter: Mutagenese , Escherichia coli , Antibiotikum , Multidrug-Resistenz
Freie Schlagwörter (deutsch): Effluxpumpen , Random-Mutagenese-Methoden , Effluxpumpeninhibitoren , AcrAB-TolC
Freie Schlagwörter (englisch): random mutagenesis , efflux pumps , efflux pumps inhibitor , AcrAB-TolC
Institut: Medizinische Univ.-Klinik und Poliklinik
Fakultät: Medizinische Fakultät / Universitätsklinikum
DDC-Sachgruppe: Medizin und Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Kern, Winfried (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.11.2010
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 15.06.2011
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