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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-81406
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8140/


Rather, Liv Juliane

Structure and mechanism of benzoyl-CoA epoxidase BoxAB from Azoarcus evansii : an elegant strategy to break the aromatic ring

Struktur und Mechanismus der Benzoyl-CoA Epoxidase BoxAB aus Azoarcus evansii

Dokument1.pdf (9.877 KB) (md5sum: 3256ebf136b7621362fd8f0d493cb596)

Kurzfassung in Englisch

The metabolism of aromatic compounds has attracted broad attention due to its quantitative importance in the biogeochemical carbon cycle (transforms 10 - 20 % of the biomass) and its powerful chemistry coping with the high resonance energy of the conjugated cyclic ring. In the case of benzoate three different degradation strategies were developed by Nature depending on the availability of oxygen: the established aerobic beta-ketoadipate pathway, the anaerobic benzoyl-CoA pathway, and a CoA-dependent aerobic metabolism.

In this study, the CoA-dependent aerobic metabolism of benzoate was investigated in the beta-proteobacterium Azoarcus evansii. The genes and several intermediates of this benzoate oxidation (box) pathway had been revealed previously to this work, but the key steps of ring cleavage were not defined. Ring cleavage involves an oxygenase BoxB, a reductase component BoxA, and a ring-hydrolyzing enzyme BoxC. The following results were achieved.

1. The key reaction steps were investigated by 18O-labeling and derivatization studies. Subsequent mass spectrometric analysis revealed that the two enzymes BoxA and BoxB did not form the 2,3-dihydrodiol of benzoyl-CoA, as formerly postulated, but the 2,3-epoxide. The enzyme system BoxAB was named benzoyl-CoA 2,3-epoxidase, in which BoxA acts as the NADPH oxidizing reductase component and BoxB as the epoxidase component. The epoxide is not aromatic anymore and may be in equilibrium with its oxepin isomer. This epoxide formation activates the ring for the following hydrolytic ring cleavage and represents an elegant strategy to cope with the high resonance energy of aromatic substrates. A ring cleavage mechanism was postulated, in which the enoyl-CoA hydratase BoxC opens the ring by sequential integration of two molecules of water possibly via an oxepin intermediate. Thus, BoxC was named 2,3-epoxybenzoyl-CoA dihydrolase. Bioinformatic studies showed that this metabolic strategy is not only restricted to A. evansii, but is present in many other bacteria (about 5 % of all sequenced species so far), in particular alpha- and beta-proteobacteria. A similar strategy is also used in the metabolism of phenylacetic acid and 2-aminobenzoate.

2. EPR and Mössbauer spectroscopy studies showed that the reductase BoxA is an unusual reductase component, since it does not contain plant-type or Rieske-type [2Fe-2S] centers, as found in other reductases of bacterial multicomponent monooxygenases. Instead, BoxA harbors one FAD and two oxygen sensitive [4Fe-4S] clusters to transfer two electrons from NADPH to BoxB.

3. The structure of the epoxidase BoxB was solved by X-ray crystallography, which revealed that BoxB harbors a diiron center bound in a four-helix bundle similar to ribonucleotide reductase, stearyl-ACP delta9 desaturase, soluble methane monooxygenase, and other bacterial multicomponent monooxygenases. These enzymes share the characteristic diiron binding motif (E/D-Xn-EXXH)2, but lack any significant sequence identity. They catalyze quite diverse oxygen-dependent reactions, but presumably share a common O2 activation mechanism. Comparison of the complex composition of similar diiron monooxygenases showed that the benzoyl-CoA 2,3-epoxidase system BoxAB is a new member of bacterial multicomponent monooxygenases.

4. The diiron center of the epoxidase BoxB was investigated by EPR and Mössbauer spectroscopy. A mechanism, how BoxB activates dioxygen and forms the epoxide, was postulated based on the structure, EPR and Mössbauer spectroscopic data.


Kurzfassung in Deutsch

Nach den Kohlenhydraten bilden die Aromaten die größte Klasse organischer Verbindungen. Der bakterielle Metabolismus dieser aromatischen Verbindungen ist daher wichtig für den gesamten biogeochemischen Kohlenstoffkreislauf. Die hohe Resonanzenergie der konjugierten Ringe stellt dabei eine besondere Herausforderung für die Bakterien dar. Für Benzoesäure, die einfachste aromatische Säure, sind drei bakterielle Abbauwege bekannt: der etablierte aerobe beta-Ketoadipat Weg, der anaerobe Benzoyl-CoA Weg und ein CoA-abhängiger aerober Weg. Der CoA-abhängige aerobe Weg kann als eine Hybridform der anderen beiden Wege angesehen werde, da er einerseits Sauerstoff benötigt und andererseits alle Intermediate als CoA-Ester vorliegen. Die Gene und einige Intermediate dieses 'Benzoat oxidierenden' (box) Stoffwechselweges im beta-Proteobakterium Azoarcus evansii waren zwar bekannt, allerdings war unklar, wie der aromatische Ring durch das Oxygenase/Reduktase-System BoxAB aktiviert und durch die Hydratase BoxC gespalten wird.

Durch massenspektrometrische Analyse von 18O-markierten Produkten und gezielter Produktderivatisierung wurde gezeigt, dass BoxAB Benzoyl-CoA zu einem dearomatisierten Epoxid umsetzen. Die Enzyme BoxAB wurden Benzoyl-CoA 2,3-Epoxidase genannt, wobei BoxA eine NADPH-oxidierende Reduktase und BoxB die Epoxidase darstellen. Diese Epoxidbildung stellt eine elegante Strategie dar, die aromatische Resonanzenergie zu überwinden. Weiter konnte ein Mechanismus formuliert werden, wie die Hydratase BoxC den Ring unter Einbau von zwei Wassermolekülen spaltet (möglicherweise über ein Oxepin-Intermediat). Das Enzym BoxC wurde 2,3-Epoxybenzoyl-CoA Dihydrolase benannt. Bioinformatische Studien zeigten, dass diese metabolische Strategie in vielen anderen Bakterien vorkommt (ca. 5 %, hauptsächlich alpha- und beta-Proteobakterien). Auch Phenylessigsäure wird nach einem ähnlichen Prinzip abgebaut.

Da BoxB eine ungewöhnliche Reaktion katalysiert, aber außer zu der Phenylacetyl-CoA Epoxidase PaaA (noch nicht strukturell aufgeklärt) kaum Ähnlichkeit zu anderen Enzymen zeigt, stellte sich die Frage, wie das aktive Zentrum diese Reaktion katalysiert. Die Metalloenzyme BoxA und BoxB wurden EPR- und Mössbauer-spektroskopisch untersucht. Die Struktur von BoxB mit gebundenem Substrat Benzoyl-CoA konnte durch Kristallographie aufgeklärt werden. BoxB besitzt ein charakteristisches Zwei-Eisen-Zentrum, das in einem Vier-Helixbündel von zwei Histidinen, drei Glutamaten und einem Aspartat gebunden ist. Dieses Motiv findet sich auch in der Ribonukleotid-Reduktase, der Stearyl-ACP delta9-Desaturase und in bakteriellen komplexen Monooxygenasen (multicomponent monooxygenases) wie der löslichen Methan-Monooxygenase. Anhand der Struktur, der EPR- und Mössbauer-spektroskopischen Untersuchungen wurde ein Mechanismus formuliert, wie Sauerstoff am Zwei-Eisen-Zentrum aktiviert und das Epoxid gebildet wird. EPR- und Mössbauer-Spektroskopie der Reduktase BoxA zeigten, dass sie im Vergleich zu anderen Reduktasen bakterieller komplexer Monooxygenasen ungewöhnlich ist, da sie neben einem FAD zwei Sauerstoff-sensible [4Fe-4S]-Cluster besitzt, über die sie Elektronen von NADPH auf die Epoxidase BoxB überträgt. Aufgrund der Zusammensetzung des Enzymsystems BoxABC wurde die Benzoyl-CoA 2,3-Epoxidase als ein neues Mitglied der bakteriellen multikomponenten Monooxygenasen definiert.


SWD-Schlagwörter: Azoarcus , Azoarcus evansii , Mikrobieller Abbau , Enzym , Kristallstruktur , Elektronenspinresonanz , Elektronenspinresonanzspektroskopie , Mößbauer-
Freie Schlagwörter (deutsch): Benzoyl-CoA , Benzoat , Epoxidase , Epoxid , Zwei-Eisen-Zentrum
Freie Schlagwörter (englisch): benzoyl-CoA , benzoate , epoxidase , epoxide , diiron center
Institut: Institut für Organische Chemie und Biochemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Fuchs, Georg (Prof. Dr.)
Quelle: J. Biol. Chem. 2010 285: 20615-20624. , J. Biol. Chem. 2011 jbc.M111.236893. , Biochim Biophys Acta. 2011.
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.01.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 20.06.2011
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