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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-83124
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8312/


Weihberger, Oliver

Quantitative examination of state-dependent modulations of stimulus-response relations in cortical networks in vitro

Quantitative Untersuchung zustanddsabhängiger Modulationen der Reiz-Antwort Verhältnisse in kortikalen Netzwerken in vitro

Dokument1.pdf (36.843 KB) (md5sum: a69c296709bf5ffc7ccf017d96cc8305)

Kurzfassung in Deutsch

Eine der erstaunlichsten Eigenschaften des zentralen Nervensystems (CNS) ist dessen präzise und zuverlässige Arbeitsweise trotz einer inhärenten zugrundeliegenden neuronalen Variabilität. Vorhergehende Arbeiten haben gezeigt, dass variable Antworten auf wiederholte elektrische oder sensorische Reize durch zustandsabhängige Reiz-Antwort Beziehungen bestimmt werden. Das heißt, fortdauernde und induzierte neuronale Netzwerkaktivität interagieren miteinander, so dass der der Zustand des Netzwerks zum Zeitpunkt der Stimulation entscheidend über die neuronale
Anregbarkeit bestimmt. Um die Prinzipien neuronaler Netzwerkaktivität besser zu verstehen, zum Beispiel in der Informationsverarbeitung oder für die bidirektionale Kommunikation in neuroprothetischen Geräten, ist es äußerst wichtig die genaue Form der Reiz-Antwort Modulation und ihre zugrundeliegenden Mechanismen zu studieren. Diese Dissertation untersucht quantitative Modelle für zustandsabhängiger Reiz-Antwort Beziehungen in generischen neuronalen Netzwerken in vitro. Unser Hauptinteresse galt den Wechselwirkungen die zwischen spontaner
und induzierter Aktivitätsdynamik entstehen, und wie diese neuronale Antworten formen und modulieren. Unser Ziel war es die Gesetzmäßigkeiten für die Modulationen der Reiz-Antwort Beziehungen zu identifizieren um dadurch in zielgerichteter Interaktion mit neuronal Netzwerkaktivität reproduzierbarere Antworten zu erlangen. Dazu haben wir Zellkulturen der Großhirnrinde der Ratte auf Mikroelektroden arrays (MEAs) mit 60 Ableitorten hergestellt. Einzelne Neurone bilden Nervenfortsätze aus und formen ein paar Tage nach dem Aussäen der suspendierten
Zellmasse ein Netzwerk. Raum-zeitliche neuronale Netzwerkaktivität kann aufgrund stabiler Ableitbedingungen zuverlässig über mehrere Wochen abgeleitet und elektrisch stimuliert werden.
Dieses Modellsystem ermöglicht es die netzwerk-intrinsischen Prinzipien der Antwortvariabilität zu studieren, unabhängig von anderen Faktoren wie Verhaltens-oder Bewusstseinszustand oder
Modulationen durch Rückkopplungen aus anderen Gehirnregionen. Wir entwickelten ein Stimulationsparadigma mit geschlossenem Regelkreis welches uns ermöglichte Reize zu vordefinierten Zeitpunkten relativ zu spontaner Aktivität zu setzen. Dies erhöhte die Reproduzierbarkeit der Antworten und erleichterte dadurch eine systematische Untersuchung zustandsabhängiger Reiz - Antwort Beziehungen.

Spontane Aktivität bestand aus wiederkehrenden Phasen von synchronem netzwerkweitem bursten, sogenannten Netzwerk Bursts. Die Hauptkenngröße für die Länge von Netzwerk Bursts
war die Dauer des vorhergehenden Intervals. Einige Netzwerke entwickelten 20 - 60 slange, wiederkehrende Phasen intensiven burstens mit drei-bis vierfach erhöhter globaler Feuerrrate,
sogenannten Superbursts. Netzwerkaktivität während Superbursts hat sich deutlich von der Aktivität während regelmäßigem bursten abgehoben. Evozierte Antworten bestanden aus einer präzisen und zuverlässigen frühen Komponente < 15 - 20 ms nach dem Reiz und einer variableren späten Komponente, dietypischerweise > 25 ms nach dem Reiz begann, mit scheinbar beliebigem Anfangszeitpunkt und Länge. Antwortlänge und -Verzögerung waren Funktionen der Dauer der Inaktivität . vor der Stimulation. Antwortlänge an nahegelegenen Ableitorten (relativ zum Stimulationsort)
mit früher und später Komponente nahmen zu und sättigten mit y(t) = A(1 – e-alpha t).
Gleichzeitig verkürzten sich die Verzögerungen der späten Komponente an entfernten Ableitorten exponentiell mit y(t) = Be-beta t + C. Der Parameter beta korrelierte mit der durchschnittlichen Anzahl an Spikes in spontanen Bursts von dem jeweiligen Ableitort. Die Antwortvariabilität war in Netzwerken mit Superbursts am größten, da die Stimulation während Superbursts die längsten Antworten mit hoher Zuverlässigkeit hervorrief. Direkt nach Superbursts waren die Antworten kürzer oder die Stimulation löste keine Spikes aus. Die Verzögerung der frühen Antwortkomponente nahm während Superbursts zu, nach Superbursts nahmen sie wieder ab und stabilisierte sich schließlich auf einem präzisen Spike-Zeitpunkt zwischen Superbursts.

Stimulation mit geschlossener Rückführung reduzierte die Variabilität der Antwortlänge und erhöhte die Antwortzuverlässigkeit. Reproduzierbarere Antworten stellten ein wertvolles Mittel für Untersuchungen des Einflusses der Inhibition und synaptischer Verstärkung auf spontane und induzierte Aktivitätsdynamik dar.

Blockieren der GABAergen Neurotransmission mit Picrotoxin (PTX) ergab längere Netzwerk Bursts mit mehr Spikes bei, jedoch, längeren Intervallen. Die durchschnittliche Anzahl an Spikes über lange Ableitphasen war unverändert. Antworten wurden länger, hatten mehr Spikes und kürzere Verzögerungen. Die Modulation der Antwort Verzögerung hielt in disinhibierten Netzwerken an. Dies weist auf einen Prozess von Netzwerk-Depression durch synaptische
Vesikelentleerung während Burst und Wiederauffüllung während Inaktivität hin. Steigerung der synaptischen Übertragung durch Überexprimierung des Proteins DOC2B ergab ~ 39 % mehr Spikes pro Netzwerk Burst bei gleichzeitig ~ 72 % längeren Intervallen in unausgereiften Netzwerken < 20 Tage in vitro (DIV). Die Länge der Netzwerk Bursts war nicht beeinträchtigt. Netzwerk Burst Aktivität in ausgereiften Netzwerken (≤ 20 DIV) war insgesamt nicht signifikant verändert. Antwortverzögerungen änderten sich selektiv mit DOC2B. Ableitorte mit Verzögerungen < 45 ms nach dem Reiz in Kontrollen hatten größere Verzögerungen mit DOC2B. Ableitorte mit Verzögerungen ≤ 45 ms nach dem Reiz in Kontrollen hatten kleinere Verzögerungen mit DOC2B. DOC2B ergab mehr Spikes pro Antwort bei unveränderter Antwortlänge und führte somit zu erhöhter intra-burst Spike Aktivität. Der Parameter beta der Erholung von Burst-induzierten Depression nahm mit DOC2B in jungen Netzwerken ab wohingegen er in alten Netzwerken zunahm. Langsamere und schnellere Erholung in jungen beziehunsgweise alten Netzwerken repräsentiert eine unterschiedliche Wirkung des Proteins DOC2B in Abhängigkeit des Reifezustandes des Netzwerkes.

Zusammenfassend haben wir explizite Gesetzmäßigkeiten für die Modulation evozierter Antworten durch spontane Aktivitätsdynamik in generischen neuronalen Netzwerken in vitro identifiziert.
Der Zeitpunkt des Reizes relativ zu spontanem Bursten, die Balance zwischen Exzitation und Inhibition, die Entfernung zum Stimulationsort, eine aktivitätsabhängige Anregbarkeit und der
Gesamtzustand des Netzwerks bestimmen die Antworteigenschaften. Unsere wichtigsten Befunde können durch synaptische Kurzzeit-Depression aufgrund Vesikelentleerung während Bursts gefolgt von Wiederauffüllung und akivitätsabhängiger Inaktivierung der Anregbarkeit erklärt werden.
Superbursts lassen jedoch vermuten dass die Resourcenverfügbarkeit ansich zustandsabhängig ist. Zusätzliche modulatorische Einflüsse wie zum Beispiel Glia-Neuron Interaktion sind vermutlich vorherrschend während Superbursts.


Kurzfassung in Englisch

One of the most astonishing feature of the central nervous system (CNS) is its precise and reliable operation despite of an inherent underlying neuronal variability. Previous work showed that variable responses to repeated electrical or sensory stimuli are determined by state-dependent stimulus-response relations. That is, ongoing and induced neuronal network activity interact with each other such that the state of the network at the moment of stimulation critically influences neuronal responsiveness. To better understand the principles of neuronal network activity dynamics, for instance in information processing or for bidirectional communication in neuroprosthetic devices, it is utterly important to study the exact forms of stimulus-response modulations and their underlying mechanisms. This thesis examined quantitative models for state-dependent stimulus-response relations in generic neuronal networks in vitro. We were interested in the interactions that arise between spontaneous and evoked activity dynamics and how these shape and modulate neuronal responses. Our goal was to identify the rules for the modulations of stimulus-response relations, to obtain reproducible responses in targeted interaction with neuronal network activity. For this purpose, we prepared rat cortical cell cultures on 60-site microelectrode arrays
(MEAs). Single neurons grow neurites and form a network a few days after seeding of the dissociated cell tissue. Spatial-temporal neuronal network activity can be reliably recorded and electrically stimulated over several weeks due to stable recording conditions. This model system allows to study the network-intrinsic principles of response variability, independent of other factors like behavioral or conscious state or top-down modulations by afferent activity from other brain regions. We developed a closed-loop stimulation paradigm that enabled us to place stimuli at pre-defined times relative to spontaneous activity. This increased response reproducibility and thereby facilitated a systematic examination of state-dependent stimulus-response relations.

Spontaneous activity consisted of recurring periods of synchronous network wide bursting, so-called network bursts. The major determinant for the length of network bursts was the duration of the preceding interval. Some networks developed 20 - 60 s
long recurring periods of intense bursting with three-to fourfold increased global firing rate, so-called superbursts. Network activity during superbursts markedly deviated from that during regular bursting. Evoked responses consisted of a precise and reliable early component < 15 - 20 ms post-stimulus and a more variable late component typically starting > 25 ms with seemingly arbitrary onset timing and length. Response length and delay was a function of the duration of pre-stimulus inactivity t. Response length at proximal recording sites (relative to the stimulation site) with early and late component increased and saturated with y(t) = A(1 – e-alpha t). Concomitantly, the delays of late responses at distal recording sites decayed exponentially with y(t) = Be-beta t + C. The parameter beta correlated with the average number of spikes in spontaneous bursts from that site, suggesting an activity-dependent modulation of excitability. Response variability was largest in 9 networks with superbursts as stimulation during superburst periods elicited the longest responses with high reliability. Responses were shorter or stimulation even failed to induce spikes directly after superbursts. Early response spikes shifted to longer delays during superbursts, decayed and finally stabilized at precise spike-timing after and in-between superbursts, respectively.
The variability of response length was decreased and response reliability was increased by closed-loop feedback stimulation. More reproducible responses provided a valuable tool to investigate the influence of inhibition and synaptic enhancement on spontaneous and evoked activity dynamics.

Disinhibition by blocking GABAergic neurotransmission with picrotoxin (PTX) yielded longer network bursts with more spikes at, however, longer intervals. The average number of spikes over long recording periods was unchanged. Responses became longer, had more spikes and smaller delays. Modulation of response delay by the duration of pre-stimulus inactivity persisted in disinhibited networks. This suggests a process of network depression by synaptic vesicle depletion during bursts and replenishment during inactivity. Facilitation of synaptic transmission by overexpression of the protein DOC2B yielded ~39 % more spikes per network burst at concomitantly ~72 % longer intervals in immature networks < 20 days in vitro (DIV). Network burst length was not affected. Network burst activity in mature networks (≥ 20 DIV) was overall not significantly changed. Responses delays changed directionally with DOC2B. Recording sites with delays ≤ 45 ms post-stimulus during control had increased delays with DOC2B. Recording sites with delays > 45 ms post-stimulus during control had decreased delays with DOC2B. This temporal domain likely reflects the suggested role of DOC2B as a pre-synaptic Ca2+-sensor that translocates to the plasma membrane and thereby facilitates vesicle priming and fusion. DOC2B yielded more spikes per response at unchanged response length and thus facilitated intra-burst spike activity. The parameter β of recovery from burst-induced depression decreased in young networks whereas it increased in old networks with DOC2B. Slower and faster recovery in young respectively old networks represents a distinct action of the protein DOC2B depending on the network’s maturation state.

In summary, we identified explicit rules for the modulation of evoked responses by spontaneous activity dynamics in generic neuronal networks in vitro. Stimulus timing relative to spontaneous bursting, the balance between excitation and inhibition, the distance to the stimulation site, activity-dependent excitability and the overall activity-state of the network determines response properties. Our main findings can be explained by short-term synaptic depression due to vesicle depletion during bursts followed by replenishment and activity-dependent inactivation of excitability. Superbursting activity, however, suggests that resource availability itself is state dependent. Additional modulatory effects such as glia-neuron interaction presumably prevail during superbursts.


SWD-Schlagwörter: Nervennetz , Elektrostimulation , Variabilität , Synapse , Burst
Freie Schlagwörter (deutsch): Mikroelektroden array , zustandsabhängig , Reiz-Antwort Verhältnis
Freie Schlagwörter (englisch): microelectrode array , state-dependent , stimulus-response relations
PACS Klassifikation 82.37.Rs , 87.19.ld , 87.85.eg , 87.19.lj , 87.19.L
Institut: Institut für Biologie 3
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Egert, Ulrich (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.09.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 10.10.2011
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