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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-83204
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8320/


Lingott, Torsten Jens

Crystal structure analysis of a snake venom metalloproteinase in complex with an inhibitor as basis for considerations on the proteolytic activity and the hemorrhagic mode of action

Kristallstrukturanalyse einer Schlangengift-Metalloproteinase in Komplex mit einem peptid-ähnlichen Inhibitor als Ausgangspunkt für Betrachtungen der proteolytischen Aktivität und der hämorrhagischen Wirkungsweise

Dokument1.pdf (14.685 KB) (md5sum: 4634d73878f7c0f7c643c16830708544)

Kurzfassung in Englisch

Structural studies on BaP1 from Bothrops asper in complex with a peptidomimetic inhibitor were performed to gain insights into structure-activity relationship of small molecules inhibiting snake venom metalloproteinases (SVMPs) and to elucidate the proteolytic reaction mechanism of metzincins as well as the hemorrhagic mode of action of SVMPs. Additionally, comprehensive multiple sequence analysis and MD simulations were performed to achieve determinants to distinguish between hemorrhagic and non-hemorrhagic SVMPs.
Crystals of the inhibitor complex were obtained under different conditions at distinct pH values (4.5, 6.5, 7.5, and 9.0), either by cocrystallization or crystal soaking. All crystals belonged to the same space group. The structures were solved at 1.46, 1.14, 1.08, and 1.05 Å resolution. The peptidomimetic inhibitor is fixed by hydrogen bonds, hydrophobic interactions, and a rarely ocurring cation-π interaction. The hydrogen bonding network resembles that of an antiparallel β-sheet. Four subsites of the protein are involved in inhibitor binding (S1, S1', S2', S3') which only affects the substrate binding site while the rest of the protein is unperturbed. Thereby, both pocket-flanking loops shift inward by about 3 Å. An unexpected finding in all four high-resolution structures was the double conformation of a entire loop region which consists of four residues and is located directly before the invariant Met-turn.
A prerequisite for comprehensive multiple sequence alignments of the metalloproteinase domain of SVMPs were the entries of SVMP sequences in the UniProtKB/SwissProt database. Accordingly, the zinc-binding motif of 132 different sequences was analyzed. The former zinc-binding moiety characterized by twelve positions could be elongated by six positions at which the physico-chemical character of the amino acid residues was shown to be invariant. Moreover, an invariant three-residue motif (147-NLG-149) was found in all analyzed sequences. The first and the last residue of the Met-turn are also highly conserved, while the central position allows slight variance towards hydrophobic residues. The majority of the interacting counterparts of the invariant residues are also conserved. Their importance could be shown through structural and sequential comparison. The most variable part of the domain is located directly after the most invariant part, the zinc-binding moiety. Interestingly, the variable loop is divided into two parts by the invariant Met-turn, whereby the loop after the Met-turn is composed of eleven amino acid residues in all P-classes of SVMPs. In contrast, length of the first loop varies in between seven and twelve residues (8-11 residues in P-I SVMP sequences, 9-11 (in one case 12) in P-II, 10 (in one case 8) in P-III). Two conserved disulfide bonds occur in all P-classes (Cys117-Cys197, Cys159-Cys164). A third one (Cys157-Cys181) can be found in most of the P-II and P-III class proteins but only in some of the P-I SVMPs. In the case of odd cysteinyl residues the exposure to the surface and the potential of forming inter-domain disulfide bonds was analyzed. Hence, three putative positions have been found. Alignments of the primary structure of hemorrhagic and non-hemorrhagic P-I SVMPs showed that differences are marginal and mostly located in the two variable loop regions. MD simulations revealed hemorrhagic proteins to be flexible in the first part of the loop and rigid in the second part. In contrast, non-hemorrhagic SVMPs show reverse flexible behavior. The mutational modification of the entire loop led to interchanged flexible behavior in in silico experiments.
X-rays structures revealed that the zinc coordination geometry changes from four-coordinate tetrahedral to five-coordinate square pyramidal upon inhibitor binding regardless of the pH value. The coordination distances of the histidine Nε-atoms and the zinc ion are not varying in between the distinct structures. Similarly, the distance between the Oε1-atom of the catalytic glutamate residue and the hydroxamatic substructure of the inhibitor is invariant and the structures are virtually the same in structural alignments. Due to these properties the dependency on the pH value of the proteolytic activity can not be explained by atomic distances. Furthermore, MD simulations indicated that the energetic expenses of the side chain rotamer changes seem to be entirely compensated by the interaction network and its binding results in an energetically favored process.
Through pharmacophore modeling and virtual screening new scaffolds of BaP1 inhibitors were searched. Several databases were screened with the developed pharmacophore models but no significant inhibitory effect was found by subsequent biological testing of 74 screening hits. Even the inclusion of the gained information into further pharmacophore model development only led to slight inhibitory effects. Through MD simulations it could be shown that aliphatic elongation of the P1' residue of the inhibitor would produce higher affinity towards Bap1 which could be proven experimentally. Thus, calculation of binding affinities by MD simulations may be a valuable tool for future inhibitor design approaches.


Kurzfassung in Deutsch

Die Strukturuntersuchungen an BaP1 aus Bothrops asper in Komplex mit einem peptid-ähnlichen Inhibitor wurden mit dem Ziel durchgeführt neue Einblicken in die Struktur-Aktivitäts-Beziehung von Kleinmolekül-Inhibitoren gegenüber Schlangengift-Metalloproteinasen (SVMPs) zu erlangen sowie den proteolytischen Mechanismus von Metzincinen und die hämorrhagische Wirkungsweise von SVMPs aufzuklären.

Die Kristalle des Inhibitor-Komplexes wurden unter verschiedenen Bedingungen mit unterschiedlichen pH-Werten (4.5, 6.5, 7.5, 9.0) entweder durch Kokristallisation oder durch Tränkung der Kristalle erhalten. Alle Kristalle gehörten der gleichen Raumgruppe an und die Strukturen wurden bis zu einer Auflösung von 1.46, 1.14, 1.08 bzw. 1.05 Å gelöst. Der peptid-ähnliche Inhibitor wird durch Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophobe Interaktionen und einer selten beobachteten Kation-Pi-Wechselwirkung fixiert. Das Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk entspricht dem eines antiparallelen β-Blattes, wobei vier verschiedene Bindungsstellen des Proteins in die Wechselwirkungen eingebunden sind (S1, S1’, S2’, S3’). Dies führt dazu, dass nur die Substratbindetasche des Proteins affektiert wird, das restliche Protein aber von der Bindung nicht betroffen ist. Die Bindetasche verengt sich dabei beidseitig um ca. 3 Å. In allen vier hochauflösenden Strukturen wurde eine Doppelkonformation einer Loop-Region gefunden, die aus vier Aminosäureresten besteht und sich direkt vor dem invarianten Met-turn befindet.

Als Grundlage der weitreichenden Sequenzvergleiche der Metalloproteinasen-Untereinheit von Schlangengiftenzymen dienten die aktuellen Einträge in der UniProtKB/SwissProt-Datenbank. Dementsprechend wurde das Zink-Binde-Motiv von 132 verschiedenen Sequenzen untersucht. Dabei konnte das invariante Aminosäure-Muster um sechs Positionen erweitert werden, an denen die physiko-chemischen Eigenschaften die Gleichen sind. Außerdem konnte ein Motiv, welches aus drei Aminosäureresten (147-NLG-149) besteht, in allen untersuchten Sequenzen gefunden werden. Der erste und der letzte Aminosäurerest des Met-turns scheinen auch konserviert zu sein, wohingegen die mittlere Position von verschiedenen hydrophoben Resten belegt wird. Die Mehrheit der mit den invarianten Positionen wechselwirkenden Aminosäureresten ist ebenfalls konserviert. Bezeichnenderweise befindet sich der flexibelste Teil des Proteins direkt nach dem am wenigsten flexiblen Teil - dem Zink-Binde-Motiv. Geteilt wird dieser Bereich nur durch den hochkonservierten Met-turn, wobei der zweite Teil in allen Sequenzen aus elf Resten besteht. Der erste Teil variiert in der Anzahl zwischen sieben und zwölf Resten. Zwei konservierte Disulfid-Brücken sind in allen P-Klassen vorhanden (Cys117-Cys197, Cys159-Cys164), wohingegen die Dritte (Cys157-Cys181) in den meisten P-II und P-III Proteinen, aber nur in wenigen der P-I Exemplare vorliegt. Im Falle von einer ungeraden Anzahl von Cystein-Resten der Proteine wurde die Positionierung an der Proteinoberfläche und die Möglichkeit zur Ausbildung von Untereinheit-verknüpfenden Disulfid-Bindungen analysiert. Dabei wurden drei vermeintliche Positionen gefunden. Vergleiche der Primärstruktur von hämorrhagischen und nicht-hämorrhagischen P-I SVMPs zeigen, dass eine hohe Ähnlichkeit besteht und einzig in den erwähnten Bereichen signifikante Unterschiede bestehen. MD Simulationsrechnungen zeigen außerdem, dass hämorrhagische Proteine eher im ersten Teil flexibel sind, wohingegen nicht-hämorrhagische Proteine eine hohe Flexibilität im zweiten Teil besitzen. Durch Austausch der loop-Bereiche konnten die Eigenschaften in in silico Experimenten umgekehrt werden.

Die Anordnung der Zink-Koordination wechselt durch die Bindung des Inhibitors von vierfach (tetraedrisch) zu fünffach (quadratische Bipyramide) unabhängig des pH-Wertes. Die Bindungsabstände der Nε-Atome variieren dabei nicht zwischen den verschiedenen Strukturen. in gleicher Weise bleibt der Abstand zwischen dem Oε1-Atom des katalytischen Glutamat-Restes und der Hydroxamat-Substruktur des Inhibitors bestehen. Infolgedessen kann eine Erklärung der pH-Abhängigkeit der proteolytischen Aktivität durch Atombindungsabstände ausgeschlossen werden. Zusätzlich deuten MD Simulationsrechnungen an, dass der energetische Aufwand der Änderung der Seitenkettenrotamere bei der Inhibitorbindung komplett durch das Wechselwirkungsnetzwerk kompensiert werden kann und dieser Prozess energetisch bevorzugt ist.

Durch Pharmacophore Modeling und virtuelles Screenen wurden neue Strukturen von BaP1-Inhibitoren gesucht. Mehrere Datenbanken wurden dabei mit den entwickelten Pharmacophor-Modellen gescreent, aber es konnten keine signifikanten Inhibitionseffekte in den nachfolgenden biologischen Test von 74 ausgewählten Substanzen gefunden werden. Mit Hilfe von MD Simulationsrechnungen konnte allerdings gezeigt werden, dass eine Verlängerung des P1’-Restes zu höheren Affinitäten zu BaP1 führen sollte. Dies konnte anhand biologischer Testung nachgewiesen werden und der Rückschluss kann gezogen werden, dass die Berechnung von Bindungsaffinitäten durch MD Simulationen ein wertvolles Werkzeug für zukünftige Inhibitor-Design-Ansätze sein kann.


SWD-Schlagwörter: Röntgenstrukturanalyse , Schlangengift , -Enzym , Molekulardynamik
Freie Schlagwörter (deutsch): Röntgenstrukturanalyse , Metalloproteinasen , Schlangengift , Pharmacophore Modeling , Zink , Schlangengiftenzyme , Sequence Alignement , Hämorrhagie
Freie Schlagwörter (englisch): X-Ray analysis , high resolution , snake venom metalloproteinase , zink , pharmacophore modeling , toxin , sequence alignment , hemorrhagic activity
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Merfort, Irmgard (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.12.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 14.10.2011
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