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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-83272
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8327/


Lutz, Sascha

Centrifugal microfluidic platforms for protein and nucleic acid analysis

Zentrifugal mikrofluidische Plattformen für die Analyse von Proteinen und Nukleinsäuren

Dokument1.pdf (11.099 KB) (md5sum: 9d904272b686de9363694f917a49100f)

Kurzfassung in Englisch

Two centrifugal microfluidic systems for diagnostic applications are presented in this thesis. One system allows the processing of immunoassays for protein analysis while the other enables an automated detection of nucleic acids.
The immunoassay system consists of a polymer cartridge featuring microfluidic channels and a device with a rotary drive and a detection unit. Each cartridge features four structures for the parallel processing of immunoassays. Six cartridges can be attached to a rotor of said device to allow the parallel processing of up to 24 assays. The microfluidic structures of each cartridge include a chamber for mixing and dissolution of reagents, a reaction chamber, integrated waste handling and valves for the control of highly wetting fluids. The fluidic layout is furthermore complemented with a blood plasma separation module for integrated sample preparation. A volume of 4 µL blood plasma can be separated from a sample of 10 - 15 µL whole blood with a CV of 6 %.
To enable the control of highly wetting fluids a novel siphon valve including a hydrophobic patch is developed. The valve allows the repetitive control of surfactants containing fluids to perform serial washing operations in the immunoassay cartridge.
An investigation regarding the valving process for various detergent containing fluids often employed in biochemical and diagnostic applications exhibits a drastically improved valving process employing the presented siphon valve. The hydrophobic patch is manufactured automatically with a dispenser and carbon black particles allow a quality control of the coating. Furthermore, a novel unidirectional shakemode protocol is developed within this thesis enabling long-term mixing and dissolving processes with highly wetting fluids.
To demonstrate the systems ability to perform diagnostic applications two types of immunoassays are implemented. A sandwich assay for the quantification of IL8 with a sensitivity of 105 pg/mL is demonstrated with a time-to-result of 45 min. An
investigation regarding the assays reproducibility reveals intra- and inter-cartridge coefficients of variation (CVs) of 3 - 9 % depending on the sample concentration. The inter-batch reproducibility for antigen containing samples is between 13.8 % and 27.5 % and 47.5 % for the negative control. Furthermore, a competitive assay for the quantitative measurement of estradiol with a sensitivity of 100 pg/mL is shown with a time to result of 45 min and the results are compared to a commercially available
microtiterplate-based assay.
The nucleic acid detection system for the first time reports on a fully integrated foilbased microfluidic cartridge for isothermal amplification of DNA exploiting the recombinase polymerase amplification (RPA). The foil cartridge is structured by
thermoforming. The cartridge features pre-storage of all liquid and dry reagents for the reaction. The fluidic layout allows the parallel testing of up to 30 samples. All fluidic unit operations like mixing, dissolving, valving and aliquoting are investigated
experimentally. The presented system features a reduction of consumed reagents by a factor of five and reduced handling steps for the user. The recombinase polymerase amplification in the foil disk allows the detection of the antibiotics resistance marker mecA with a high sensitivity of < 20 copies out of a sample with a time-to-result of 20 min. The system features compatibility to a commercially available real-time PCR device that is used for processing and detection.


Kurzfassung in Deutsch

Inhalt dieser Dissertation ist die Entwicklung zweier zentrifugal-mikrofluidischer Systeme für diagnostische Anwendungen. Eines der Systeme ermöglicht dieProzessierung von Immunoassays für die quantitative Analyse von Proteinen. Daszweite System erlaubt die automatisierte Detektion von Nukleinsäuren.
Das Immunoassay-System besteht aus einer Polymer-Cartridge mit integriertenmikrofluidischen Kavitäten und einem Gerät zur Prozessierung und Detektion. JedeCartridge weist vier identische fluidische Strukturen zur parallelen Prozessierung von
Immunoassays auf. Die Fixierung von bis zu sechs Cartridges auf einem Rotorermöglicht die gleichzeitige Durchführung von bis zu 24 Tests. Die mikrofluidischenStrukturen beinhalten eine Kammer zum Resuspendieren und Mischen vonReagenzien, eine Reaktionskammer mit immobilisierten Antikörpern, eine Kammerzur Aufnahme des Flüssigabfalls und Ventile zum Schalten hochbenetzender Fluide.
Das fluidische Layout kann zudem um eine, in dieser Arbeit entwickelte,Probenaufnahme erweitert werden. Hiermit kann eine Separation von 4 µLBlutplasma aus Vollblutproben eines Volumens von 10 - 15 µL mit einem CV von 6 %durchgeführt werden.
Die Entwicklung der Immunoassay-Cartridge beinhaltet ein neues Ventil zur Kontrollehochbenetzender Fluide. Das Ventil basiert auf einem Siphon mit lokalerhydrophober Beschichtung. Dieses erlaubt ein mehrfaches kontrolliertes SchaltenTensid-haltiger Fluide zur Durchführung serieller Waschschritte. Eine experimentelle
Überprüfung des Schaltverhaltens des Ventils unter Anwendung von Puffern mitTensid- und Proteinanteilen wird präsentiert. Die Aufbringung der hydrophobenBeschichtung kann automatisiert erfolgen und eine Prozesskontrolle ist möglich,durch die in der Beschichtung enthaltenen carbon black Partikel.
Um die Anwendbarkeit des Systems im diagnostischen Bereich zu demonstrieren,werden im Rahmen der Dissertation zwei Immunoassays implementiert. EinSandwich-Immunoassay zur quantitativen Analyse von IL8 mit einer Sensitivität von105 pg/mL wird gezeigt. Die Zeit für die Durchführung des Immunoassays beträgt45 min. Experimente zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Resultate ergeben einen intra- und inter-Cartridge Variationskoeffizienten (CV) von 3 – 9 % inAbhängigkeit der Probenkonzentration. Die Reproduzierbarkeit zwischenverschiedenen Chargen ergibt einen CV von 13.8 – 27.5 % für Proben mit Antigenen.
Der CV der Negativkontrolle beträgt 47.5 %. Zusätzlich wird ein kompetitiverEstradiol-Immunoassay in der Cartridge innerhalb von 45 min durchgeführt. DieSensitivität des implementierten Tests beträgt 100 pg/mL.
Im zweiten Teil der Dissertation wird zum ersten Mal ein vollintegriertes Folienbasiertes zentrifugal-mikrofluidisches System für die isotherme Amplifikation vonNukleinsäuren mittels Rekombinase Polymerase Amplifikation demonstriert.
Mikrofluidische Strukturen werden durch Thermoformen in eine COP-Folie integriert.
Das Folienlayout ermöglicht die parallele Prozessierung von bis zu 30 Proben. AlleEinheitsoperationen zur Durchführung der Reaktion, wie Mischen, Lösen vonReagenzien, Schalten von Fluiden sowie Aliquotieren sind experimentell untersuchtund validiert. Die resultierende Folien-Cartridge beinhaltet zudem alle Flüssig- und Trockenreagenzien zur Durchführung der isothermen Amplifikation. Die präsentiertePlattform vermindert die Volumina der für den Assay benötigten Reagenzien auf einFünftel und reduziert die manuellen Arbeitsschritte für den Anwender. Die Rekombinase Polymerase Amplifikation in der Folien-Cartridge ermöglicht dieDetektion von Antibiotikaresistenzmarkern mit einer hohen Sensitivität von wenigerals 20 Kopien innerhalb von 20 min. Die Prozessierung und Detektion erfolgt ineinem kommerziell erhältlichen real-time Thermocycler der in vielen Laboratorien
vorhanden ist.


SWD-Schlagwörter: Mikrofluidik , Mikrosystemtechnik , Lab on a Chip , Immunoassay , Diagnostik
Freie Schlagwörter (deutsch): isotherme Amplifikation
Freie Schlagwörter (englisch): isothermal amplification
Institut: Institut für Mikrosystemtechnik
Fakultät: Technische Fakultät (bisher: Fak. f. Angew. Wiss.)
DDC-Sachgruppe: Technik
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Zengerle, Roland (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.09.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 07.11.2011
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