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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-83413
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8341/


Altevogt, Andrea

Synthese und Anwendung neuartiger Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Systeme in DNA

Synthesis and application of new Förster-Resonance-Energy-Transfer (FRET) systems in DNA

Dokument1.pdf (6.484 KB) (md5sum: ac60e5f765ebb680ab1cbc46500df982)

Kurzfassung in Deutsch

Das Prinzip des Förster-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) wird in den Biowissenschaften häufig zur Untersuchung von intra- und intermolekularen Wechselwirkungen von Makromolekülen angewandt. Auf Grund der vielen Anwendungsmöglichkeiten solcher Systeme gibt es einen großen Bedarf an Farbstoffen mit passenden spektroskopischen Eigenschaften. Um solche Systeme in der FRET Analytik anwenden zu könne, muss eine klare Abhängigkeit zwischen dem Abstand der Farbstoffe und der resultierenden FRET-Effizienz bestehen. Weiterhin müssen die Farbstoffe eine große chemische Robustheit und eine hohe Sensitivität aufweisen. Als Gerüstmolekül für solche Abstandsabhängigkeitsuntersuchung erwies sich synthetische DNA als besonders geeignet. In dieser Arbeit wurden fünf verschiedene Farbstoffe in unterschiedlichen Anwendungen auf ihre Eignung als FRET-Fluorophore untersucht. Um definierte Abstände zwischen den Farbstoffen zu erhalten wurden sie kovalent an DNA gebunden. Auf Grund der überragenden Stabilität der Farbstoffe war es meist möglich diese als Bausteine an beliebiger Position im DNA-Strang einzubauen. In einer ersten Untersuchung wurde ein FRET-System bestehend aus einem Carbostyril-Donor und einem Ru(II)-bathophenanthrolin Akzeptor auf seine Eignung als molekulares Lineal getestet. Die von unseren Kooperationspartnern aus der Gruppe von Prof. Kumke an der Universität Potsdam durchgeführten FRET-Messungen zeigten eine klare Abstandsabhängigkeit der FRET-Effizienz, wenn der tatsächliche räumliche Abstand der Farbstoffe betrachtet wurde. Lediglich für größere Abstände zwischen den Farbstoffen zeigte sich eine Abweichung von den Berechnungen. Um den Messbereich des FRET-Systems zu vergrößern wurde es zu einem drei-Farben-FRET-System erweitert, indem der Ru-Komplex als Relay-Farbstoff verwendet wurde und entweder ein Dispers Blau 3 Quencher oder ein Cy5-Derivat als dritter Farbstoff eingesetzt wurde. Systematische Untersuchungen und Vergliche der experimentellen Ergebnisse mit den theoretischen Berechnungen ergaben, dass mit diesen Systemen ein neues Instrument zur Untersuchung der Wechselwirkungen von drei Molekülen hergestellt wurde. Weiterhin ist es mit diesem System möglich, die relativen Positionen der drei Farbstoffe zueinander zu bestimmen.
In einer weiteren Anwendung wurde ein FRET-System hergestellt, bei dem zwei Akzeptoren in der Nachbarschaft zu einem Donor angeordnet sind. In diesem System diente der Ru-Komplex als Donor und das Cy5-Derivat wurde als Akzeptor verwendet.


Kurzfassung in Englisch

The principle of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) is widely applied in life sciences to study intra- and intermolecular interactions of macromolecules. Due to the increasing number of applications of such FRET-Systems there is an ongoing search for new chromophores with tailor-made spectroscopic properties. In order to use FRET-based analysis such systems need to show a clear relationship between the distance of the chromophores and the resulting FRET efficiencies. Further requirements are robustness and high sensitivity. Synthetic DNA proofed to be a perfect tool for such distance dependency studies. Herein five different chromophores were tested in various applications towards their suitability as FRET dyes. In order to achieve defined distances between the chromophores they were covalently attached to synthetic DNA. Due to the outstanding stability of the chromophores this attachment was mainly possible via a building block strategy allowing the placement within the DNA at will. In a first approach a FRET-System consisting of a carbostyril donor and a Ru(II)-bathophenanthroline acceptor was tested towards its suitability as a molecular ruler. The FRET measurements performed by our cooperation partners from the group of Prof. Kumke at the University of Potsdam showed a clear distance dependency of the FRET efficiencies when the operative in-space distance between the chromophores was taken into account. Only for larger distances between the two chromophores a variance from the model was obtained. In order to maximize the working range of the system it was extended to a three color FRET system by using the Ru(II)bathophenanthroline complex as a relay chromophore and by applying either a Disperse Blue 3 or a Cy5-derivative as a third chromophore. Systematic investigations of these FRET systems and comparison of the experimental data with theoretical considerations revealed that these systems represent a novel FRET tool box for the investigation of interactions of three partners allowing for the determination of the positions of the dyes to each other.
In a further approach a FRET system bearing two acceptors in the neighborhood of one donor was synthesized. In this system the Ru-complex served as a donor and the Cy5-derivative was used as an acceptor.


SWD-Schlagwörter: Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer , DNS , Fluoreszenz , Anthrachinon , DNS-Synthese
Freie Schlagwörter (deutsch): Ru-Bathophenanthrolin-Komplex , Molekulares Lineal , Drei-Farben-FRET
Freie Schlagwörter (englisch): DNA, FRET-Systems , Three color FRET-Systems , DNA synthesis , FRET
Institut: Institut für Organische Chemie und Biochemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Bannwarth, Willi (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.10.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 04.11.2011
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