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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-83489
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8348/


Förster, Kathrin

Thermodynamische, kinetische und einzelmolekülspektroskopische Untersuchungen an der mitochondrialen H +-ATPsynthase aus Saccharomyces cerevisiae

Thermodynamic, kinetic and single molecule spectroscopic studies on the H+ -ATPsynthase from Saccharomyces cerevisiae

Dokument1.pdf (15.033 KB) (md5sum: 1ba82b834afef777ea21bcfde9199667)

Kurzfassung in Deutsch

Die H+-ATPsynthase aus Saccharomyces cerevisiae (MF0F1) ist ein transmembraner Enzymkomplex, der einen Protonentransport über die innere Mitochondrienmembran mit der Synthese und Hydrolyse von ATP koppelt. Das Enzym wurde aus S.cerevisiae-Zellen isoliert und biochemisch charakterisiert. Eine MS-Untersuchung nach einer SDS-PAGE zeigte die Anwesenheit aller bekannten Untereinheiten außer der Untereinheit K. MF0F1 wurde in Liposomen rekonstituiert und die ATP-Synthese durch eine elektrochemische Potentialdifferenz der Protonen angetrieben ([Delta]pH und [Delta][phi]). Der maximale Turnover der ATP-Synthese war T=120s-1.
In vivo liegt MF0F1 als Dimer vor. Eine native PAGE zeigte, dass MF0F1 bei der Isolation in monomerer Form gewonnen wurde. Um zu klären, ob eine Dimerisierung in der Liposomenmembran während der Rekonstitution stattfindet, wurde eine Konzentrationsreihe von 0,1 bis 1 MF0F1 pro Liposom hergestellt. Der Turnover ist unabhängig von der Anzahl der Enzyme pro Liposom und damit auf monomeres MF0F1 zurückzuführen.
Es wurde die Abhängigkeit des Turnovers von der Phosphatkonzentration bei verschiedenen pHa-Werten gemessen. Die erhaltenen Km-Werte nahmen mit steigendem pHa ab. Wurde der Turnover der ATP-Synthese gegen die Konzentration der Phosphatspezies H2PO4- aufgetragen, konnten alle Messpunkte durch eine einzige Michaelis-Menten-Kinetik beschrieben werden (Km=120±20 µM, v_max=120±20s-1). Daraus wurde gefolgert, dass H2PO4- die Phosphatspezies ist, die während der ATP-Synthese an MF0F1 bindet.
Die Abhängigkeit des Turnovers der ATP-Synthese vom pHi bei vier verschiedenen [Delta][phi] (133mV, 56mV, 27mV, 0mV) zeigte jeweils einen sigmoidalen Verlauf. Es wurde bei jedem [Delta][phi] ein maximaler Turnover bei pHi=5,0 erreicht, wobei dieser maximale Turnover abhängig von [Delta][phi] war. Das Ergebnis wies darauf hin, dass [Delta]pH und [Delta][phi] weit ab vom chemischen Gleichgewicht kinetisch nicht äquivalent sind.
Das H+/ATP-Verhältnis beschreibt die Anzahl der Protonen, die pro synthetisiertem ATP über die Membran transportiert werden. Während der ATP-Synthese passieren die Protonen die Membran über den c-Ring, wobei jede c-Untereinheit ein Proton bindet. MF0F1 besitzt 10 und die H+-ATPsynthase aus Chloroplasten (CF0F1) 14 c-Untereinheiten, was vermuten lies, dass das H+/ATP-Verhältnis unterschiedlich ist. Um das Verhältnis zu quantifizieren, wurden Messungen nahe des thermodynamischen Gleichgewichts mit beiden Enzymen durchgeführt. Auf Grundlage der chemiosmotischen Theorie wurde daraus das H+/ATP-Verhältnis für MF0F1 (n=2,9±0,3) und CF0F1 (n=3,9±0,3) berechnet. Zur Kontrolle wurde aus den Messungen die Freie Standard-Enthalpie der Phosphorylierungsreaktion für beide Enzyme bestimmt. Die Werte für MF0F1 ([Delta]G'°=37±3kJmol-1) und CF0F1 ([Delta]G'°=36±3kJmol-1) waren im Rahmen der Fehler gleich.
H+-ATPsynthasen zeigen während der Katalyse zyklische Konformationsänderungen, bei denen ein Teilkomplex des Enzyms (Rotor) relativ zu den anderen Untereinheiten (Stator) rotiert. Es wurde untersucht, ob es möglich ist, den Rotationsmechanismus an MF0F1 mit Hilfe von Einzelmolekül-FRET-Spektroskopie zu zeigen. Zunächst wurde eine Doppel-Cysteinmutante von MF0F1 hergestellt, die sowohl im Rotor als auch im Stator eine Cysteinmutation besaß. Die Doppel-Cysteinmutante wurde statistisch mit zwei Fluorophoren (ATTO532 und ATTO610) markiert. Eine SDS-PAGE zeigte, dass das Enzym an den Untereinheiten b und [gamma] und an einem endogenen Cystein der Untereinheit OSCP markiert wurde. Das doppelt markierte Enzym wurde in Liposomen rekonstituiert und spFRET-Messungen durchgeführt. Diese Methode ermöglicht es, über die Effizienz des Energietransfers zwischen ATTO532 (Donor) und ATTO610 (Akzeptor) Rückschlüsse auf den Abstand der beiden Fluorophore voneinander zu ziehen. Unter nicht katalytischen Bedingungen war der Abstand zwischen den Fluorophoren konstant. Ein Histogramm der mittleren FRET-Effizienzen zeigte drei nahe beieinander liegende Populationen mit geringer FRET-Effizienz und eine Population mit hoher FRET-Effizienz. Ein Vergleich mit einem zuvor entwickelten Homologiemodell von MF0F1 zeigte, dass die drei Populationen mit geringer FRET-Effizienz auf den strahlungslosen Energietransfer zwischen den Fluorophoren an den Untereinheiten [gamma] und b in den drei möglichen Ausrichtungen des Rotors relativ zum Stator zurückgeführt werden konnten. Die Population mit hoher FRET-Effizienz wurde der Wechselwirkung zwischen den Fluorophoren gebunden an den Untereinheiten b und OSCP zugeordnet. Messungen des spFRET unter ATP-Hydrolysebedingungen ergaben Photonenbursts mit variierender FRET-Effizienz. Es wurden 67 zweistufige und 13 dreistufige Photonenbursts gefunden. Damit wurde zum ersten Mal der Rotationsmechanismus an einer mitochondrialen H+-ATPsynthase mittels Einzelmolekülspektroskopie gezeigt.


Kurzfassung in Englisch

The H+-ATPsynthase from Saccharomyces cerevisiae (MF0F1) is a transmembrane enzyme complex that couples a transport of protons across the inner mitochondrial membrane with the synthesis and hydrolysis of ATP. The H+-ATPsynthase was isolated from S.cerevisiae cells. The subunit composition was investigated by HPLC-MS/MS after a SDS-PAGE and it was shown that all subunits are present in the isolated enzyme except the K-subunit. For the measurements of the ATP synthesis rate MF0F1 was reconstituted into liposomes. ATP synthesis was measured after generation of an electrochemical potential difference of protons ([Delta]pH and [Delta][phi]). The maximum turnover of ATP synthesis was 120s-1.
In vivo MF0F1 exists as a dimer. Therefore, the oligomeric state was analyzed by BN-PAGE showing that the purified MF0F1 is a monomer. If more than one enzyme is integrated into the liposome membrane, the formation of dimers is possible. To investigate whether a dimerization takes place the enzyme concentration was varied between 0.1 to 10 MF0F1 per liposome during reconstitution and the rate of ATP synthesis was measured. The turnover of ATP synthesis does not depend on the number of MF0F1 per liposome and was due to monomeric MF0F1.
The dependence of the rate of ATP synthesis on the phosphate concentration was measured at 6 different pH_out. The Km-values increased with increasing pH_out. However, when the turnover of ATP synthesis was analyzed as a function of the concentration of the monoanionic phosphate species, H2PO4-, all data could be described by one Michaelis-Menten kinetics (Km=120±20µM, v_max=120±20s-1). It was concluded that H2PO4- is the phosphate species that binds to MF0F1 during ATP synthesis.
The turnover of ATP synthesis as a function of pH_in at four different [Delta][phi] (133mV, 56mV, 27mV, 0mV) was measured. It resulted in a sigmoidal dependence on pH_in at each [Delta][phi]. For each [Delta][phi] a maximum turnover was reached at pH_in=5.0, however, this maximum turnover depended on [Delta][phi]. The result suggested that there is no equivalence of [Delta]pH and [Delta][phi] far away from the equilibrium.
The H+/ATP-ratio describes the number of protons that are translocated across the membrane to synthesize one ATP. Proton translocation through MF0F1 occurs via the c-ring. Each c-subunit binds one proton. MF0F1 contains 10 and the H+-ATPsynthase from chloroplasts (CF0F1) contains 14 c-subunits. It was suggested, that the H+/ATP-ratio of both enzymes differs. To quantify the H+/ATP-ratio of both enzymes, measurements at the thermodynamic equilibrium of the phosphorylation reaction were carried out. The [Delta]pH was determined where ATP synthesis and hydrolysis were in equilibrium and the H+/ATP-ratio for MF0F1 (n=2,9±0,3) and CF0F1 (n=3.9±0,3) were calculated using the chemiosmotic theory. As an additional control the Gibbs Free Energy of the phosphorylation reaction, was determined for both enzymes. The same [Delta]G'° was obtained for MF0F1 ([Delta]G'°=37±3kJmol-1) and CF0F1 ([Delta]G'°=36±3kJmol-1) within the error limits.
H+-ATPsynthases show cyclic conformational changes during catalysis. One part of the enzyme (rotor) rotates relatively to the rest of the enzyme (stator). The rotation mechanism of MF0F1 was investigated by single molecule spectroscopy. First, a double cysteine mutant of MF0F1 was constructed which contained a cysteine mutation within the rotor and the stator. Starting with a single cysteine mutant of MF0F1, which contains a cysteine mutation in the b-subunit (stator), a second cysteine mutation was inserted into the [gamma]-subunit (rotor). This mutant was labelled statistically with two fluorescent dyes (ATTO532 and ATTO610). A SDS-PAGE showed the labelling of the subunits b and [gamma]. In addition the subunit OSCP which contains an endogeneous cysteine was labelled. The double labelled enzyme was reconstituted into liposomes and single molecule fluorescence-resonance-energy-transfer was measured. This method allows to determine the distance between a donor (ATTO532) and an acceptor (ATTO610) by measuring the efficiency of the energy transfer. When using non-catalytic conditions the distance between the fluorophors was constant. A histogram of the averaged FRET efficiencies revealed three populations with low FRET efficiencies and one population with a high FRET efficiency. A comparison with those determined in a homology model of MF0F1 showed, that the three populations with low FRET efficiencies were due to the energy transfer between the fluorophors bound to the subunits b and [gamma] in the three possible orientations of the rotor relatively to the stator. The population with a high FRET efficiency was attributed to the energy transfer between fluorophors bound to the subunits b and OSCP. Measurements in the presence of ATP resulted in photon bursts with varying FRET efficiency. About 67 photon bursts with two steps and 13 photon bursts with three steps were found.


SWD-Schlagwörter: Wasserstoff-ATPase , Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer , Saccharomyces cerevisiae , Rekonstitution , Enzymkinetik , Konformationsänderung
Freie Schlagwörter (deutsch): mitochondriale H+-ATPsynthase , H+/ATP-Verhältnis , Proteoliposom
Freie Schlagwörter (englisch): mitochondrial H+-ATP synthase , H+/ATP ratio , proteoliposome
Institut: Institut für Physikalische Chemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Gräber, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 23.07.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 16.11.2011
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