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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-83713
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8371/


Klein, Christian Peter

Selektive biokatalytische Hydroxylierung von Prolin und Prolinanaloga mittels Eisen(II)/alpha-Ketoglutarat abhängigen Prolinhydroxylasen

Selective biocatalytic hydroxylation of proline and proline analogues by ferrous(II)/alpha-ketoglutarate dependent proline hydroxylases

Dokument1.pdf (3.408 KB) (md5sum: 3c3bb9718a8b8378103863224f3cb4fb)

Kurzfassung in Deutsch

Die enzymkatalysierte selektive Oxidation von nicht-aktivierten Kohlenstoff-Wasserstoff Bindungen ist von großer Bedeutung für die Generierung von enantiomerenreinen Substanzen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem durch Eisen(II)/alpha-Ketoglutarat abhängige Prolinhydroxylasen drei Hydroxyproline und zahlreiche hydroxylierte Prolinanaloga regio- und stereoselektiv aufgebaut werden.
trans-4-Prolinhydroxylase (transP4H), cis-4-Prolinhydroxylase (cisP4H), cis-3-Prolinhydroxylase Typ I (cis3PH_I) und cis-3-Prolinhydroxylase Typ II (cisP3H_II) wurden in Anwesenheit von Chaperonen durch das gleiche Expressionssystem heterolog in E. coli produziert. Es wurde ein Aktivitätstest etabliert, mit dem die Selektivitäten der Prolinhydroxylasen durch HPLC-Analytik einfach und schnell nebeneinander zu identifizieren sind. Bei der Charakterisierung der isolierten Enzyme zeigte sich eine starke Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Eisen(II)/Ascorbinsäure Konzentration. Durch gerichtete Mutagenese der Prolinhydroxylasen wurde neben Varianten mit deutlich verminderter Aktivität auch eine Variante mit erhöhter Aktivität erhalten. Es wurde nachgewiesen, dass neben alpha-Ketoglutarat auch andere alpha-Ketosäuren als Cofaktoren von den Prolinhydroxylasen genutzt werden, allerdings mit deutlich verminderten Aktivitäten. Aufgrund der geringen Stabilität der isolierten Enzyme wurde ein in vivo Verfahren entwickelt, mit dem Hydroxyproline in einfachen Schüttelkulturen effizient im präparativen Maßstab erhalten werden. Insbesondere die Isolierung der Hydroxyproline wurde hierbei gegenüber dem publizierten Verfahren stark vereinfacht. Für die Untersuchung von Prolinanaloga wurde ein in vitro Assay etabliert, der neue Produkte durch HPLC und Massenspektrometrie identifiziert. Diese werden ebenfalls durch Ganzzellbiotransformation in einem Hochzelldichtemedium präparativ produziert und isoliert.
Prolinhydroxylasen sind ein einfacher und umweltschonender Weg, synthetisch wertvolle Verbindungen zu generieren, deren chemische Synthese nicht oder nur mit sehr großem Aufwand möglich ist. Durch die hohe Regio- und Stereoselektivität der enzymatischen Reaktion entfällt eine Trennung von Stereoisomeren. Aufgrund der hohen Flexibilität des Systems sind neue Isoenzyme und Substrate leicht zu integrieren und zu charakterisieren („one system fits all“).


Kurzfassung in Englisch

Enzyme catalyzed selective oxidations of non activated carbon-hydrogen bonds are of great importance for the access to enantiomerically pure compounds. In this work, a process for the regio- and stereoselective generation of three hydroxyprolines and numerous hydroxylated proline analogues by ferrous(II)/alpha-ketoglutarate dependent proline hydroxylases was developed.
trans-4-proline hydroxylase (transP4H), cis-4-proline hydroxylase (cisP4H), cis-3-proline hydroxylase type I (cis3PH_I) and cis-3-proline hydroxylase type II (cisP3H_II) were heterologously expressed in presence of chaperons using a common E. coli expression system. An activity assay was established, based on HPLC-analytics, which allowed a simple und rapid characterization of the different proline hydroxylase selectivities in parallel. For in vitro conversions, it was found that an appropiate concentration of ferrous(II)/ascorbate is crucial for proline hydroxylase activity. Besides alpha-ketoglutarate, proline hydroxylases are capable of using other alpha-keto acids for proline hydroxylation, though with strongly reduced activities. Site-directed mutagenesis experiments of the proline hydroxylases resulted in variants with significantly reduced activities in most cases, however, a variant with increased activity was also found. Due to the low stability of the isolated enzymes, an in vivo procedure was evolved, which allowed an efficient preperative scale production of hydroxyprolines in simple shake flask cultures. The isolation of hydroxyprolines was strongly facilitated compared to the published procedure. For the investigation of proline analogues, an in vitro assay was established which allowed the identification of new compounds via HPLC and mass spectrometry. Whole-cell biotransformations in high cell density medium allowed the production of these in a preperative scale, too.
Proline hydroxylases provide a simple and environmentally friendly way for the generation of synthetically important compounds, whose chemical synthesis is not or only with with great efforts possible so far. Because of the high regio- and stereoselectivitiy of the enzymatic reaction, a separation of stereoisomers can be obmitted. Based on the great flexibility of the system, new isoenzymes and substrates can easily be integrated and characterized („one system fits all“).


SWD-Schlagwörter:
Freie Schlagwörter (deutsch): Enzymkatalyse , Hydroxyprolin , Regio- und Stereoselektivität , alpha-Ketoglutarat abhängige Eisen(II) Oxygenasen
Freie Schlagwörter (englisch): enzyme catalysis , hydroxyproline , regio- and stereoselectivity , alpha-ketoglutarate dependent iron(II) oxygenases
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Müller, Michael (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.10.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 05.12.2011
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